薛冲冲 张俊辉 林影 韩双艳

脂肪酶（Lipase，EC 3.1.1.3），指一系列能在油-水界面水解三酯酰甘油的酶类。其中米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucormiehei lipase，RML）是一种重要的、有代表性的脂肪酶，它可以催化酯水解、酯合成、酸解、醇解、氨解、内酯化、转酯化等多种类型的反应［1］。由于RML具有独特的催化结构，并且能显示高度的底物1，3位置专一性［2］，使其相对于其他一些工业脂肪酶，如南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）具有更好的底物选择性和特异性。因此其在油脂、制药、香精香料、化工等领域有着重要的应用价值［3］。

毕赤酵母表达系统具有可进行高密度发酵、表达量较高、对蛋白质进行修饰、糖基化程度低等优点，应用该系统成功地表达了大量的外源蛋白［4，5］。本实验室也将RML在毕赤酵母中进行了表达，但是其表达量比较低，造成生产成本较高，和商业化酶相比仍有较大的差距。因此有必要提高RML在毕赤酵母中的表达水平，降低其成本和价格，促进其工业化大规模使用。

2004年 Ahn等［8］将来源于哈茨木霉内切葡聚糖酶II（THEGII）的CBD与嗜热脂肪芽孢杆菌的L1脂肪酶在酿酒酵母中融合表达，融合蛋白CBDLinker-L1Lipase相比较L1-Lipase的分泌量会显著提高7倍。故本研究尝试通过该CBD与RML在毕赤酵母中进行高效的融合表达，以期获得高酶活力的RML，为进一步的降低应用于工业生产的RML的生产成本，有目的改善RML的相关酶学性质奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 Pichia pastoris GS115、菌株E.coli Top10F'由本实验室保存，重组质粒pPICZαA-RML由本实验室构建、pUC57-CBD-L由金斯瑞生物科技有限公司合成，质粒 pPICZαA 购自Invitrogen公司。

1.1.2 培养基 LB培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％氯化钠，根据需要添加100mg/mL博来霉素，终浓度为25μg/mL。培养基YPD、 MD、BMGY、 BMMY配方参考Invitrogen公司操作手册。

1.1.3 试剂 酵母氮源YNB（Yeast Nitrogen Base）、蛋白胨均购Difco公司；酵母抽提物购自Oxford公司；Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker和限制性内切酶购自TaKaRa公司，其他试剂均为市售国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的设计 为了获得相应的目的基因片段 CBD和RML需设计特异性的引物进行扩增。其中扩增来源于 THEGII的目的片段 CBD 使用模板pUC7-CBD，上游引物 CBDp1：CCGGAATTCCAGCAGACAGTTTG，含 EcoR I 酶切位点（以下划线示出）及保护碱基；下游引物 CBDp2：ATAACCGCGGTGATGAGGTTG，含 Sac II 酶切位点（以下划线示出）及保护碱基。扩增RML基因使用模板 pPICZαARML，上游引物 RMLp1：ATAACCGCGGGTTCCAATTAAGAGACAAT，含Sac II 酶切位点（以下划线示出）及保护碱基；下游引物RMLp2：ATTATTGCGGCCGCTAGTACACAAACCAGT，含Not I 酶切位点（以下划线示出）及保护碱基。引物合成由上海捷瑞生物科技有限公司完成。

1.2.2 CBD-RML的克隆 以pUC7-CBD为模板，CBDp1和CBDp2为引物进行PCR扩增目的片段CBD，反应体系为模板 1μL；primerstar HS为 25μL；20mmol/L 的上下游引物各 1μL，加无菌水至总体积为 50μL。反应条件为：98℃预变性 5min；98℃变性 15s，55℃退火 30s，72℃延伸 90s，共25 个循环；第25 个循环，72℃延伸5min。同理，以pPICZαA-RML为模板，RMLp1和RMLp2为引物进行PCR扩增目的片段RML，反应体系和反应条件同上。所获得的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化。

1.2.3 重组质粒pPICZαA-CBD-RML（简称“pPICZ-αA-CRML”）的构建 当构建重组质粒pPICZαACRML时，将PCR产物CBD用EcoR I和Sac II双酶切，RML用Sac II和Not I双酶切，同时将质粒pPICZαA用EcoR I和Not I双酶切，在T4连接酶的作用下构建重组质粒pPICZαA-CRML，然后用 CaCl2转化法转入 Top10F'，在 Zeocin+的 LB（25μg/mL）平板上涂板，过夜培养。提取阳性转化子质粒，对pPICZαA-CRML进行EcoR I和Not I 双酶切鉴定；鉴定正确后，委托上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。

1.2.4 重组毕赤酵母的构建 通过 LiCl 法将Sac I 线性化的重组质粒pPICZαA-CRML转化宿主菌GS115转化物涂布于YPDS（Zeocin+）平板上，30℃培养2-3d。

我国确立和推进社会主义市场经济以来，中央和地方政府的经济立法始有成效，但对保护支持中小企业的立法仍有欠缺。2002年我国发布《中小企业促进法》，启动了保护支持中小企业发展的立法。2017年第十二届全国人民代表大会常务委员会第29次会议修订通过《中小企业促进法》，从2018年1月1日起开始实施。修订后的《中小企业促进法》着力解决中小企业负担重、融资难和人才缺乏等具体问题，使保护支持中小企业健康发展的法律作用上了一个新台阶。但除了全国人大的立法，地方人大因地制宜的立法也是不可或缺的。由于地方政府受财力物力或其他因素制约，对地方立法支持小微企业缺乏主动性，以至这方面的立法比较滞后。

1.2.5 毕赤酵母重组菌株产重组米黑根毛霉脂肪酶酶的水解平板检测 挑取在 YPDS（Zeocin+）平板上正常生长的阳性转化子，转接到MD平板上，30℃培养 2-3d。然后挑取水解圈较大的转化子进行摇瓶发酵试验。

1.2.6 重组转化子的鉴定及摇瓶培养 经过水解平板筛选后，从MD平板上挑取水解圈较大的阳性转化子进行摇瓶培养，并命名为GS115/pPICZαACRML；同时以重组菌GS115/pPICZαA-RML为阳性对照进行摇瓶发酵试验。

将不同菌株分别接种于 25mL BMGY 培养基中，30℃，250r/min 振荡培养约 40h 至 OD600到 25-30。离心收集菌体，再将其悬浮于 25mL BMMY 培养基中，继续振荡培养，每隔24h 向 BMMY 培养基中补加甲醇至终浓度为2.0％进行诱导。

1.2.7 重组脂肪酶的酶活测定 以对硝基苯基辛酸酯最为重组脂肪酶CR和RML的最适底物，利用pNPC法测定发酵上清液中脂肪酶的活力［9］。酶活单位（U）定义为：每分钟水解底物生成1μmol对硝基苯酚所需的酶量。

1.2.8 表达产物的SDS-PAGE 分析 重组转化子GS115/pPICZαA-CRML 和 对 照 菌 GS115/pPICZαARML诱导培养 120h，取发酵上清液 50μL，以 20μL 上样，进行 12％ SDS-PAGE 电泳，考马斯亮蓝R250 染色，检测目的蛋白的表达。

2 结果

2.1 重组质粒pPICZαA-CRML的构建

构建重组质粒pPICZαA-CRML，经双酶切鉴定（图1）显示目的片段大小约为1200bp（含210bp前导肽序列），重组质粒测序结果显示插入片段大小为1233bp，与拟克隆的CRML序列一致，且读码框正确。

2.2 重组转化子的三丁酸甘油酯MM平板鉴定筛选

将构建好的重组质粒进行毕赤酵母转化试验，所获得的重组转化子接种于 MM平板（混合三丁酸甘油脂），倒置培养皿，在盖上涂 100μL甲醇，30℃诱导培养 72h后，重组转化子相对于阳性对照菌GS115/pPICZαA-RML，在菌落周围均能产生较大的透明圈，说明重组转化子能够有效地分泌脂肪酶，图2所示为MM平板上其中一个重组转化子（GS115/pPICZαA-CRML）和阳性对照菌（GS115/pPICZαARML）的水解圈比较，GS115/pPICZαA-CRML周围的水解圈要明显大于GS115/pPICZαA-RML。

图1 重组质粒pPICZαA-CRML的双酶切鉴定

图2 三丁酸甘油酯 MM板检测酵母重组菌

2.3 CBD-RML 和RML在毕赤酵母中的表达

将筛选获得的重组酵母和对照菌进行摇瓶培养，添加终浓度2％的甲醇诱导，每隔24h取样，检测重组酶酶活力和OD600值，结果（图3，图4）表明，在甲醇诱导的120h期间，GS115/pPICZαA-RML的生长状况明显好于重组菌GS115/pPICZαA-CRML，可能是由于外源基因的加入，宿主菌表达新基因需要消耗更多的资源，导致宿主菌代谢负担增加，从而影响重组菌的生长。当整合哈茨木霉的CBD到RML的N-末端后，重组酶CRML的酶活力整体比RML要高，甲醇诱导发酵产酶96h时，CRML相对RML酶活提高了近16.7％，分析可能是CBD的加入提高了融合蛋白的分泌量。

当甲醇诱导120h时，分别取以上发酵上清液20μL上样进行10％ SDS-PAGE考马斯亮蓝R250染色，结果（图5）显示，重组菌诱导表达后，整合有CBD的重组脂肪酶CRML分子质量要略高于RML（30kD），而且重组酶CRML蛋白浓度要明显高于RML，与发酵数据基本一致，即因为CBD整合到RML中，导致重组酶CRML的分泌量提高，进而在SDS-PAGE分析结果显示出重组酶CRML的蛋白条带浓度高于RML的现象。

图3 两种重组毕赤酵母的发酵生长曲线

图4 两种重组毕赤酵母产酶曲线

图5 两种重组酵母发酵上清液的SDS-PAGE

2.4 CRML 和RML的酶学性质

在 pH值 8.0的磷酸缓冲液中配制底物，分别在不同反应温度下进行酶促反应，在 30-60℃内温度曲线见图 6。由图6可知，RML在45℃时酶活力最高，而重组脂肪酶CRML的最适温度为50℃，并且在45-60℃范围内均有超过60％的酶活力。

酶的热稳定测定时，将酶置于65℃时保温，每隔2min取样测酶活力，并绘制酶的热稳定性曲线，由图7可知，两者酶的热稳定性曲线基本类似，随着时间的延长两者的热稳定性逐渐下降，反应到第8min时，CRML的相对酶活力降到仅剩7.5％，而RML的相对酶活力也只剩11％。

3 讨论

当前，微生物脂肪酶至投入工业生产20多年来，其应用领域相当广泛，包括食品工艺、造纸业、精细化学品合成业、化妆品制造业和制药等行业中，一直是酶学研究领域的热点，米黑根毛霉脂肪酶RML正是这样一种在各行业中具有潜在应用价值的酶，但是关于对RML酶活改进的文章报道还比较少，Zhang等［10］尝试将RML在酿酒酵母表面进行展示表达发现，其酶活力比较低，只有280U/L。但在实际的生产过程中，RML的应用出现了急需解决的两个主要问题：第一，较高的成本投入；第二，酶的稳定性和酶活力较差。

CBD在蛋白质工程的应用是个新的领域，许多研究表明当将CBD与异源蛋白融合表达时，大部分可以提高融合蛋白的表达量。Johanna等［11］研究了CALB和融合CBD（CBM第一家族）的CALB在以甲醇为诱导的毕赤酵母中功能性的表达，该CBD来自于厌氧性瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的纤维素酶A。研究结果显示，分泌到培养基的重组蛋白（CBD-CALB）水平近25mg/L，CBD-CALB和CALB相比有相似的比活力，且CBD-CALB吸附纤维素的能力远大于CALB。Sarath等［12］将来源于里氏木霉纤维二糖水解酶（CBHII）的CBD（CBM第二家族）融合到Saccharomycopsis Wbuligera的β-葡糖糖苷酶（BGL1）中并以酿酒酵母作为表达宿主菌，结果表明，整合CBD的融合蛋白对纤维素的水解能力提高了2-4倍，其中融合一个CBD的蛋白比融合两个CBD蛋白水解纤维素能力更强。另外Ahn等［8］将THEGII的CBD（CBM第一家族）与嗜热脂肪芽孢杆菌的L1脂肪酶在酿酒酵母中融合表达后，相比较L1-Lipase，融合蛋白CBD-Linker-L1Lipase的分泌量会显著提高7倍。本研究通过将THEGII的CBD融合到RML上后，融合蛋白CRML的表达量也有一定程度的提高，达到17％。该CBD能促进异源蛋白表达量的提高可能原因是CBD含有异源蛋白不具有的二硫键结构，而这种二硫键结构有助于融合蛋白稳定性的提高，从而阻止因与一些硫醇氧化还原酶的接触导致融合蛋白聚沉［8］。本研究中的融合蛋白CRML酶活力相比较单一的RML却只提高了17％，这可能与不同的融合酶在不同的宿主菌中表达有关系。

图6 温度对重组脂肪酶CRML和RML的酶活影响

图7 重组脂肪酶CRML和RML的热稳定性测定（65oC）

另外，融合蛋白CRML相比较RML，其最适温度提高了5℃，并且两者具有相似的热稳定性曲线。为了满足苛刻的工业生产条件，研究了65℃ 时两种酶的热稳定性曲线，结果表明CRML和RML在保温2min中后，两者相对酶活均下降超过50％，说明如何能提高RML的热稳定性也是当前的研究重点。在相关报道中，Ravalason等［13］将来源于黑曲霉纤维二糖水解酶的第一家族CBM融合到Pycnoporus cinnabarinus的漆酶上后，融合蛋白的最适温度相对于原始漆酶有一定程度的提高，但热稳定性却有所下降；Shin等［14］通过将 Clostridium stercorarium 木聚糖酶中的木聚糖结合域从催化域的N-末端转移到C-末端，改造后重组酶的最适温度下降了35℃。当增加CBM融合到不同的水解酶上后，能够引起这些水解酶的最适温度或热稳定性的各种改变，因此，很难去预测CBM的加入会对某种酶的最适温度或热稳定性的绝对变化。

基于米黑根毛霉脂肪酶RML的低酶活力，生产高成本等缺陷，并在食品、化工等领域的广泛应用前景，本研究尝试将来源于哈茨木霉的CBD整合到RML的N端并在毕赤酵母中高效表达，相比单一的RML，重组酶的酶活力最高提高了17％。获得的高活力重组脂肪酶不仅为其在工业生产中应用降低成本奠定基础，同时为人们探究CBD如何影响RML的相关酶学性质提供一定的理论依据。

4 结论

本研究成功构建了分泌型的重组质粒pPICZαACRML，实现了整合有CBD的米黑根毛霉脂肪酶CRML在毕赤酵母GS115中的高效表达，同时对RML和CRML的相关酶学性质进行了比较。结果显示，RML和CRML具有相似的最适温度和温度稳定性曲线，两者的最适作用温度分别为45℃和50℃；相比较RML，融合蛋白CRML在毕赤酵母中的表达分泌量提高了近17％，说明来源于THEGII 的CBD可以作为异源蛋白在毕赤酵母中表达的分泌增强子。

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