赵 粼，阙 斐，周晓红，刘绿叶

(1.浙江经贸职业技术学院应用工程系，浙江杭州310018;2.戴安中国有限公司上海实验室，上海200210)

茶氨酸(theanine，N-乙基-γ-L-谷氨酰胺)是茶叶中特有的非蛋白氨基酸，具有舒缓神经抗疲劳等作用，常作为功能性成分添加到食品饮料中［1］。自1950年日本学者酒户弥二郎首次从绿茶中分离茶氨酸以来，对于茶氨酸的定性、定量方法，已出现了碱式碳酸铜沉淀法、强酸性阳离子交换树脂法、薄层色谱法、气相色谱法和柱前衍生反相高效液相色谱法、直接进样蒸发光散射检测法、高效液相色谱质谱法等［2-8］。茶氨酸属于紫外区末端吸收，也无荧光发射特性，采用低波长紫外检测时干扰较大，因此，为了提高分析检测的灵敏度和分离的选择性，一般将茶氨酸进行衍生化，朱松等［2］采用OPA进行了柱前衍生后紫外检测器测定，但通常这种方法对衍生试剂的要求高，操作复杂，分析成本也大大增加。为了减少繁琐的衍生操作，李银花等［4］报道了采用蒸发光散射检测器(ELSD)来直接分析茶氨酸，但该方法通常灵敏度较低，线性范围较窄，重现性差。本文采用一种新型的高灵敏度通用型检测器-电雾式检测器直接进样分析，消除了溶剂等的干扰，以及温度变化等引起的基线漂移，采用梯度洗脱与柱后补偿进行分析，改善了分离度，降低了检测限，提高了重现性，能准确进行定量分析，且由于电雾式检测器响应因子一致原理，可以已知标准品对其他未知成分进行半定量分析，该方法具有简单、易操作等特点。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

茶叶粗提物 共三批，由杭州茶叶研究院提供;茶氨酸标准品(纯度＞97%)美国Sepulco公司;乙腈 色谱级，美国Merck公司;三氟乙酸(HPLC级)美国Fluka公司;去离子水 美国Millipore公司;其它未特别注明试剂均为分析纯。

Ultimate DGP3600高效液相色谱仪(含双三元梯度泵、自动进样器、柱温箱、Corona Ultra电雾式检测器)美国Dionex公司;YB-630空气压缩机 上海勇霸有限公司。

1.2 标准溶液配制及样品前处理

准溶液配制:称取茶氨酸适量，用水超声溶解，然后稀释配制成不同浓度的标准工作溶液，4℃避光保存。最终工作溶液浓度为1.0、2.0、5.0、10、20、50μg/mL。

样品前处理:准确称取茶叶粗提物2.0g，用水稀释定容至10mL，过0.45μm滤膜后，待进样分析。

1.3 仪器分析条件

色谱柱:Acclaim PA2 C18(5μm，4.6mm ×250mm，120Å)。流动相(左泵):A:三氟乙酸∶乙腈 =0.1∶100(V/V)，B:三氟乙酸∶水 =0.1∶100(V/V)，洗脱梯度:0～11min，A 为 100%，11～15min，A 由 100% ～60%，保持5min，然后 A立即回到100%，流速为0.5mL/min;补偿流动相(右泵)，为100%乙腈，流速0.5mL/min，进样体积:20μL，柱温:25℃。

电雾式检测器参数设置:采集频率:5Hz;过滤模式:None;雾化温度35℃;雾化气压力35.0psi;氮气流速约4L/min。

2 结果与分析

2.1 色谱条件选择

2.1.1 色谱柱与流动相的选择［2-3］由于茶氨酸为强极性化合物，在普通C18反相柱上的保留时间较弱，在死时间处出峰，且普通C18柱通常都不能兼容100%水相，容易出现疏水塌陷。因此，本文选用戴安Acclaim PA2 C18极性官能团改性柱，可以兼容100%水相，同时，耐受较低的酸性环境。在本方法中，流动相中添加了0.1%三氟乙酸，增加了选择性［3］，使得茶氨酸与其他化合物达到了基线分离。

2.1.2 采用柱后补偿分析 由于电雾式检测器同质谱仪等质量型检测器一样，也是基于雾化原理的检测器，其响应值依赖于洗脱液的雾化效率，通过增加有机相比例，可以提高雾化效率，从而增加响应值，降低检出限。同时，基于电雾式检测器响应因子一致性的原理，在相同的有机相条件下，使得各化合物的响应更趋于一致，可以通过茶氨酸的含量对其他未知化合物进行半定量分析。因此，本方法中把DGP3600高效液相色谱仪左泵设置为分析泵，右泵设为补偿泵，左边的梯度洗脱程序为色谱分离条件，有机相从低到高;右泵为100%的乙腈，作为柱后补偿流动相。

2.1.3 电雾式检测器参数优化 由于电雾式检测器的原理及智能化设计，无需对多种参数进行优化，本实验仅对雾化温度和采集频率进行了优化。当雾化温度分别为25、30、35℃，目标化合物响应值略有增加，但基线噪音也随之增加(见表1)，最后为了使雾化温度与柱温接近及综合考虑，最后选择30℃为雾化温度;采集频率分别使用2、5、10Hz进行实验，同紫外检测器一样，采集频率增加，基线噪音更明显，同时，数据量也大大增加，最后在考虑了满足峰形等要求下，选择5Hz作为检测器采集频率。

表1 不同雾化温度对茶氨酸响应值影响Table 1 The response of Theanine under different nebulization temperature

2.2 标准曲线与检出限

取所配制的系列标准工作溶液，按1.3色谱条件测定a，标准品谱图(浓度为10μg/mL)见图1，茶氨酸保留时间为8.247min。以茶氨酸峰面积Y(pA×min)与其对应的浓度X(μg/mL)进行线性回归分析，结果表明:线性方程为Y=0.1412X-0.0614，相关系数 r=0.9998，线性范围为1.0～50μg/mL，方法最低检出限为 0.50μg/mL(以 S/N=3计)，定量限为1.50μg/mL(以S/N=10计)。

图1 对照品色谱图Fig.1 The chromatogram of standard

2.3 重现性与回收率实验

重现性实验，用同一标准品(10μg/mL)分别测定5次，计算得保留时间差小于0.2min，峰面积相对标准偏差(RSD值)为0.62%(n=5)，重现性较好。取3份空白样品，分别添加 5.0、10.0、15.0μg/mL 标准工作溶液各1mL，按照“1.3”节分析测定条件，进行测定，结果见表 2，计算得回收率为 97.62%～112.13%，平均值为103.10%，RSD为0.48%～1.1%。

表2 空白样品加标回收实验Table 2 Spiked recoveries of a blank sample

2.4 样品分析结果

按照“1.3”节分析测定条件，对三批样品分别进行了三次平行测定，结果见表3。样品分析谱图见图2。

表3 样品检测结果Table 3 The results of the sample

图2 样品色谱图Fig.2 The chromatogram of sample

3 结论

本文采用最新型通用型检测器-电雾式检测器(CAD)对茶叶粗提物中的茶氨酸进行了分析，同时结合智能双三元液相色谱系统进行梯度洗脱与柱后补偿，取得了较好的分析结果。该方法最低检出限为0.50μg/mL(以 S/N=3计)，定量限为1.50μg/mL(以S/N=10计);空白样品加标回收率为97.62%～112.13%;重现性实验表明(n=5)，茶氨酸的保留时间差值小于0.2min，峰面积的相对标准偏差(RSD值)为0.62%。此方法大大提高了方法的灵敏度，取得了较好的重现性与回收率结果，同时也避免了对茶氨酸进行衍生等复杂操作。

［1］肖伟涛，朱小兰，陈波，等.制备高效液相色谱分离纯化茶氨酸对照品［J］.中草药，2004，35(2):148-150.

［2］朱松，王洪新.OPA柱前衍生高效液相色谱法测定茶氨酸的研究［J］.分析检测，2005，26(2):17-19.

［3］刘小力，李想.茶叶中茶氨酸的含量方法测定研究［J］.食品科学，2009，30(14):281-284.

［4］李银花，刘仲华，黄建安，等.高效液相色谱-蒸发光散射检测器测定茶叶中茶氨酸［J］.茶叶科学，2005，25(2):225-228.

［5］郭升平.高效液相色谱法测定茶叶中茶氨酸的研究［J］.色谱，1996，14(6):463-465.

［6］朱小兰，陈波，罗旭彪，等.高效液相色谱法测定茶叶中的茶氨酸［J］.色谱，2003，21(4):400-402.

［7］朱曙东，赵皓.氨基酸的高效液相色谱分析［J］.色谱，1994，12(1):20-23.

［8］Unno T，Suzuki Y，Kaduka T，et al.Metabolism of theanine，γ-glutamylethylamide in rats［J］.Journal of Agriculture and Food Chemistry，1999，47(4):1593-1596.