陈晓鹏，杨来志，葛国朝，崔巍，屠佳，田野

(皖南医学院弋矶山医院肝胆一科，安徽芜湖 241001)

乙酰肝素酶(也称类肝素酶，heparanase，HPSE)是一种糖苷内切酶，它通过降解细胞外基质硫酸乙酰肝素蛋白多糖，在肿瘤转移及血管生成等病理过中发挥重要作用，并在多数恶性肿瘤细胞高水平表达［1-2］。故深入研究HPSE基因的转录调控机制，对于合理调节其表达水平、探讨肿瘤生物治疗的新方法具有重要意义［3］。我们前期在克隆HPSE启动子核心片段的基础上分析发现，该启动子虽可驱动下游基因在肿瘤细胞特异性表达，但活性较低［4-5］。本研究我们拟对HPSE基因启动子上、下游邻近序列进行分段扩增，并分别分析其促转录活性，为进一步筛选、鉴定其增强子序列奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、细胞和仪器

DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker、PFX、dNTP、PCR Buffers(Takara 公司);PCR纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒(北京道普公司);无内毒素质粒大提试剂盒(北京天能生物技术有限公司);T4 DNA ligase、限制性内切酶KpnⅠ、SalⅠ、大肠杆菌DH5a感受态细胞、pEGFP-N1质粒和各种引物(上海生工生物公司合成);胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂(英国Oxoid公司);Lipofectamne 2000、DMEM培养基和RPIM-1640培养基(GIBCO公司)。人肝癌细胞BEL-7402、胃癌细胞SGC-7901(上海中科院细胞库)。PCR扩增仪(BIORAD公司)，二氧化碳培养箱(Thermo Forma公司)，倒置显微镜(OLYMPUS公司);荧光显微镜(Nikon公司);FC500MPL流式细胞仪(Backman公司)。

1.2 候选序列的确定

根据HPSE之DNA序列，设计选取10个片段作为增强子候选序列(enhx，x分别为1，2……10)，其中启动子上游6段，启动子下游4段，每个片段共1 200 bp，为避免相邻片段之间将增强子序列截为两个部分，在两相邻片段之间重叠200 bp。

1.3 重组质粒的构建与鉴定

改造载体 PEGFP-N1中的 VspⅠ位点，增加KpnⅠ、SalⅠ酶切位点，退火引物为taatGGCGCGCCaa tcgaaGGTACCgacaaACGCGTatccgaGTCGACat和taatGTC GACtcggatACGCGTttgtcGGTACCttcgattGGCGCGCCat，改造的质粒命名为pEGFP-MU，作为本研究的阴性对照载体。化学方法合成猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)增强子序列，全长237 bp。测序鉴定SV40增强子序列合成正确，设计引物，PCR扩增，并增加酶切位点(12 bp)，其中上游KpnⅠ酶切位点GGTACC，下游SalⅠ酶切位点GTCGAC，引物由上海生物工程有限公司合成。反应体系 50 μl，反应条件:95℃预变性5 min，94 ℃ 55 s，57 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，共35 个循环，最后72℃延伸10 min;将扩增的片段插入到质粒pEGFP-MU的KpnⅠ和SalⅠ两酶切位点之间，构建载体pEGFP-MU-SV40e;将连接反应液转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性菌落、提取质粒DNA，分别双酶切和PCR扩增、测序鉴定，正确者作为本实验的阳性对照载体。根据HPSE之DNA序列设计引物，从人血基因组中PCR扩增上述候选增强子序列1～10，并增加上述酶切位点，上游Kpn I位点后面序列分别与候选增强子enhx序列5'端吻合，下游SalⅠ位点后面序列分别与enhx序列3'端互补，预计enh6扩增序列长度为1 092 bp(包括完整的序列1 080 bp和酶切位点12 bp)，其余片段扩增序列长度为1 212 bp(包括完整的候选增强子序列1 200 bp和酶切位点12 bp)。同法构建实验载体pEGFP-MU-enhx并鉴定。

1.4 质粒转染和功能分析

人肿瘤细胞株BEL-7402、SGC-7901常规方法复苏、传代、冻存和培养。提取质粒，选取生长状态良好、处于对数生长期的细胞，待融合度达80%调整细胞计数，使用6孔板铺板，细胞转染按照Lipofectamine 2000说明书操作。在37℃的CO2培养箱中孵育细胞40 h。贴壁细胞用0.25%的胰酶消化后，用含血清培养基终止消化。所有转染条件相同，转染时间为48 h，然后进行荧光显微镜下观察和流式细胞分析，检测荧光强度和转染效率。实验重复3次，取平均值。

2 结 果

2.1 对照质粒的构建和鉴定

SV40增强子PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳显示，扩增条带(长度为249 bp，包括SV40增强子的完整序列和酶切位点12 bp)与预期的SV40增强子237 bp片段基本符合，条带清晰。构建的pEGFP-MU-SV40e载体行KpnⅠ和SalⅠ双酶切电泳可见2个片段，单一酶切均仅有1个片段，初步证明载体构建正确。以pEGFP-MU-SV40e重组质粒为模板，可扩增出长为SV40增强子序列片段，测序结果包含完整的SV40增强子序列，与GenBank一致。对比一致是从33 bp处至269 bp处，长度为237 bp。从 27～32 bp处为GGTACC是KpnⅠ酶切位点，从270～275 bp处为GTCGAC是SalⅠ酶切位点(图1)。

图1 SV40增强子PCR产物部分测序图Fig 1 Partial sequencing graph of PCR product of SV40 enhancer

2.2 实验载体pEGFP-MU-enhx的构建和鉴定

10个候选序列PCR产物分别经1%琼脂糖凝胶电泳显示，扩增条带与预期长度1 200 bp片段符合。构建的pEGFP-MU-enhx载体行KpnⅠ和SalⅠ双酶切电泳可见2个片段，单一酶切均仅有1个片段，初步证明载体构建正确。以pEGFP-MU-enhx重组质粒为模板，可扩增出长为1 200 bp左右的候选增强子序列片段，测序结果包含了完整的候选序列，与GenBank一致(图2)。对比一致是从33 bp处至1 232 bp处，长度为1 200 bp;27～32 bp处为GGTACC是KpnⅠ酶切位点，1 233～1 238 bp处为GTCGAC是SalⅠ酶切位点。

2.3 重组质粒的真核表达与功能分析

阴性对照质粒pEGFP-MU转染BEL-7402和SGC-7901细胞后荧光强度较弱;阳性对照质粒pEGFP-MUSV40e、实验载体 pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFP-MU-enh8转染BEL-7402和SGC-7901细胞后荧光强度较强，其余实验载体荧光强度与阴性对照相似(图3、4)。流式细胞仪分析中以发光细胞百分比代表细胞的转染效率。质粒pEGFP-MU在BEL-7402和SGC-7901细胞中的转染效率较低，质粒pEGFPMU-SV40e、实验载体 pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFP-MU-enh8转染效率较高，其余实验载体转染效率与阴性对照相似，效率较低(见表1)。

图2 第7候选片段PCR产物部分测序图Fig 2 Partial sequencing graph of of PCR product of the 7thcandidate DNA fragment

图3 各组质粒转染BEL-7402细胞荧光图Fig 3 Fluorogram of various kinds of plasmids in BEL-7402 cell

表1 各种载体在肿瘤细胞中的转染效率比较%Tab 1 Comparison of transcription efficiency of various kinds of plasmids in tumor cells %

3 讨 论

图4 各组质粒转染SGC-7901细胞荧光图Fig 4 Fluorogram of various kinds of plasmids in SGC-7901 cell

增强子是基因内的一种DNA特异序列，能够增强DNA转录活性，可与细胞核内转录因子(TF)特异结合从而极大地增强启动子活性。其结构与启动子相似，也由多个元件组成，通常为100～200 bp长度，核心组件8～12 bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在［6］。每个基因至少包含一个增强子，既可以定位于基因的两端，也可以定位在基因中间，甚至远离基因多达数千个核苷酸。但与基因编码序列不同，增强子无法仅仅根据DNA序列加以识别，必须通过实验证实。鉴定增强子的实验方法主要有DNA结构分析、序列分析和基因删除和替换等，软件预测是鉴定增强子的另一种方法，但不同的软件预测差异较大，而且结果仍需实验来验证［7］，尚难普遍应用。

本研究在前期发现SV40增强子可增强HPSE启动子表达活性［8］的基础上，参考其他文献［9-10］，选用HPSE基因启动子上、下游的部分片段作为候选序列，将其分为10段，在其上、下游引物分别添加KpnⅠ和SalⅠ酶切位点，进行PCR扩增，将其克隆插入到含有巨细胞病毒(CMV)启动子、并经改造过的真核表达载体pEGFP-MU中，构建重组载体pEGFP-MU-enhx。然后分别转染肿瘤细胞株BEL-7402、SGC-7901，通过免疫荧光观察和流式细胞仪分析方法检测增强子候选序列对CMV启动子转录活性的影响，以初步鉴定出具有增强子活性的候选序列。

为准确判断候选序列活性，本研究以未插入其他序列的质粒pEGFP-MU作为阴性对照。SV40增强子是最早发现也是迄今功能最强大的病毒增强子，其核心序列是由72 bp的碱基对重复序列构成。研究［11］表明SV40增强子修饰的人端粒酶逆转录酶启动子可以提高转录活性2～3倍，而且不影响其肿瘤特异性。我们前期研究［8］也证明，SV40增强子可以增强HPSE启动子的转录活性。本研究中我们采用PCR扩增克隆出SV40增强子序列，并引入KpnⅠ和SalⅠ酶切位点，然后将其插入到改造的质粒pEGFP-MU序列中CMV启动子上游KpnⅠ和SalⅠ酶切位点之间，构建重组质粒载体pEGFP-MU-SV40e，作为本研究阳性对照载体。电泳和测序结果表明，阳性对照质粒构建成功。

将上述3种质粒分别转染肿瘤细胞株BEL-7402、SGC-7901，通过免疫荧光观察和流式细胞仪分析方法检测各个片段对CMV启动子转录活性的影响，以初步鉴定出具有增强子活性的候选序列。

在同等条件下，将质粒pEGFP-MU、pEGFP-MUSV40e和pEGFP-MU-enhx分别转染人肿瘤细胞BEL-7402和SGC-7901。48 h后荧光显微镜下观察发现重组质粒pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFPMU-enh8e在人肿瘤细胞BEL-7402和SGC-7901中均表达较强的荧光，与阳性对照pEGFP-MU-SV40e相似。其余质粒比阳性对照pEGFP-MU-SV40e低，与阴性对照pEGFP-MU较接近。流式细胞仪与荧光观察结果一致。初步提示第6、7和8活性片段可以增强CMV启动子(驱动荧光蛋白表达)转录活性，且与SV40增强子相当。

肿瘤特异性启动子可驱动目的基因的靶向表达，增强子能够协同启动子显著增强治疗基因的表达水平。本研究初步筛选、鉴定了HPSE序列中具有增强子活性的3个DNA片段，为后续进一步筛选和鉴定有活性的增强子序列缩小了序列搜寻范围，并为将来利用HPSE增强子进行肿瘤基因治疗提供了实验依据，具有广阔的应用前景。

［1］VLODAVSKY I，FRIEDMANN Y，ELKIN M，et al.Mammalianheparanase:genecloning expression and function in tumor progression and metastasis［J］.Nat Med，1999，5(7):793-802.

［2］ILAN N，ELKIN M，VLODAVSKY I.Regulation，function and clinical significance of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis［J］.Int J Biochem Cell Biol，2006，38(12):2018-2039.

［3］SIMIZU S，ISHIDA K，OSADA H.Heparanase as a molecular target of cancer chemotherapy［J］.Cancer Sci，2004，95(7):553-558.

［4］胡良鹤，陈晓鹏.人乙酰肝素酶核心启动子的扩增及序列分析［J］.皖南医学院学报，2009，28(5):319-321.

［5］陈晓鹏，胡良鹤，王永.人乙酰肝素酶基因启动子驱动的真核细胞表达载体的构建和功能分析［J］.上海交通大学学报:医学版，2010，30(3):314-317.

［6］JASNY B R，ROBERTS L.Solving gene expression［J］.Science，2004，306(5696):629-629.

［7］葛国朝，陈晓鹏.增强子对基因表达调控的研究进展［J］.国际肿瘤学杂志，2011，38(3):173-175.

［8］王永，陈晓鹏.克隆猿猴病毒40增强子修饰人乙酰肝素酶基因核心启动子及活性分析［J］.东南大学学报:医学版，2012，31(1):12-18.

［9］卢圣栋.现代分子生物学实验技术［M］.中国协和医科大学出版社，1999:539-540.

［10］LI H S，LIU Y，LI D F，et al.Enhancement of DNA vaccineinduced immune responses by a 72-bp element from SV40 enhancer［J］.Chin Med J，2007，120(6):496-502.

［11］ZHANG W M，XUE L Y，XU Y，et al.Improvement of transcriptional activity of hTERT promoter by SV40 enhancer［J］.Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2006，35(11):691-693.