刘春辉，许斌，2，张磊，卢凯，陈恕求，2，陈明，2

(1.东南大学医学院，江苏南京 210009;2.东南大学附属中大医院泌尿外科，江苏 南京 210009)

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，占肾脏恶性肿瘤的90%，是泌尿系统常见的恶性肿瘤，其中约85%为肾透明细胞癌［1］。B细胞易位基因 1(B-cell translocation gene 1，BTG1)属于BTG/TOB家族。研究表明，该家族的所有成员都具有抗增殖活性［2］。但BTG1在肾细胞癌发生、发展中的作用尚不明确。我们前期实验发现，BTG1在肾透明细胞癌组织中低表达［3］。本研究进一步通过 Western blotting方法检测BTG1蛋白在人肾小管上皮细胞株(HK-2)、肾透明细胞癌细胞株(786-O)中的表达，并构建BTG1表达质粒转染786-O，合成BTG1干扰RNA转染HK-2，通过流式细胞仪(FACS)观察BTG1对HK-2、786-O细胞株周期和凋亡的影响，进一步明确BTG1在肾细胞癌中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 HK-2购自上海生命科学研究院细胞库，786-O购自中国科学院基础医学研究所。

1.1.2 主要试剂 鼠抗人 BTG1抗体购自 Abcam(Hong Kong)公司，兔抗人 GAPDH抗体购自 Santa Cruz公司，辣根过氧化酶标记的二抗(山羊抗鼠、山羊抗兔)购自北京中杉金桥生物技术有限公司，PVDF膜购自Millipore公司，细胞周期试剂盒购自联科生物公司，AnnexinⅤ-FITC、PI凋亡试剂盒购自UBio公司，Lipofectamin 2000转染试剂购自Invitrogen公司，pcineo质粒由南京医科大学公共卫生实验室惠赠，Top 10感受态细胞为本实验室自行保存，ECORⅠ、Mlu 1内切酶，T4连接酶购自Takara公司，ECL发光试剂购自碧云天公司，高纯度质粒中量小提试剂盒购自天根生化科技有限公司，胎牛血清购自HyClone公司，RPMI1640、DMEM培养基购自Gibco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 以含10%胎牛血清的完全培养基在37℃、5%CO2、95%饱和湿度的细胞培养箱中培养，以0.25%的胰蛋白酶消化细胞，每周传代2～3次。

1.2.2 BTG1表达质粒的构建 实验方法参见文献［3］。

1.2.3 BTG1抑制剂(BTG1-siRNA)合成 实验方法参见文献［3］。

1.2.4 细胞瞬时转染 实验方法参见文献［3］。质粒用量为 3 μg，RNA 为 200 pmol。

1.2.5 Western blotting检测BTG1蛋白表达 实验方法参见文献［3］，以GAPHD作为内参。

1.2.6 FACS检测细胞周期 细胞转染72 h后收集细胞，以75%乙醇固定，－20℃保存24 h后，以1 000 r·min－1离心 5 min，弃上清，加入 3 ml PBS，弹松细胞，静置15 min，离心后弃上清。加入1 ml细胞周期固定液，震荡5 s，静置30 min后送检。

1.2.7 FACS检测细胞凋亡 细胞转染72 h后收集细胞。PBS轻洗细胞2次，加入500 μl×binding buffer重悬细胞。细胞悬液中加入5 μl AnnexinⅤ-FITC试剂，混匀后4℃避光孵育15 min，加入10 μl PI，轻轻混匀，4℃避光孵育5 min，1 h内送检。

1.3 统计学处理

每组实验重复3次，数据采用IPSS13.0软件处理。组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Western blotting检测BTG1蛋白的表达

见图 1、2。

图1 BTG1蛋白在HK-2及786-O中的表达Fig 1 The expression of BTG1 protein in HK-2 and 786-O

图1显示，BTG1蛋白在HK-2细胞中的表达高于在786-O细胞中的表达。

图2 细胞转染后BTG1蛋白的表达Fig 2 The expression of BTG1 protein after transfection

图2显示，与空白对照相比，HK-2细胞转染BTG1抑制剂后，BTG1蛋白表达量下降。786-O细胞转染BTG1表达质粒后，BTG1蛋白表达量增高。

2.2 BTG1蛋白高表达对786-O细胞凋亡的影响

见表1、图3。

表1 786-O转染BTG1表达质粒及空白对照后细胞凋亡比率 %Tab 1 The ratio of cell apoptosis after 786-O transfected of BTG1 expression plasmid and negative control%

图3 786-O转染BTG1表达质粒后细胞凋亡流式图Fig 3 The chart of cell apoptosis after 786-O transfected of BTG1expression plasmid and negative control examined by FACS

表1、图3显示，与空白对照比较，786-O细胞转染BTG1表达质粒后，细胞早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率均增加(均P＜0.01)。

2.3 BTG1蛋白低表达对HK-2细胞凋亡的影响

见表2、图 4。

表2 HK-2转染BTG1抑制剂及空白对照后细胞凋亡比率 %Tab 2 The ratio of cell apoptosis after HK-2 transfected of BTG1 inhibitor and negative control %

图4 HK-2转染BTG1抑制剂后细胞凋亡流式图Fig 4 The chart of cell apoptosis after HK-2 transfected of BTG1 inhibitor and negative control examined by FACS

表2、图4显示，与空白对照相比，HK-2转染BTG1抑制剂后，细胞早期凋亡率下降(P＜0.01)，晚期凋亡率及总凋亡率减少，但差异无统计学意义。

2.4 BTG1对786-O细胞周期的影响

见图 5、6。

图5 786-O转染BTG1表达质粒后细胞周期柱形图Fig 5 The column chart of cell cycle after 786-O transfected BTG1 expression plasmid and negative control

图6 786-O转染BTG1表达质粒后细胞周期流式图Fig 6 The chart of cell cycle after 786-O transfected BTG1 expression plasmid and negative control

图5、6显示，与空白对照相比，786-O细胞转染BTG1表达质粒后使G0/G1期细胞增多(分别为41.18% ± 1.03% 与 30.78% ± 0.93%，P ＜ 0.01)，S期细胞减少(分别为43.07% ±2.35%与56.43% ±2.14%，P ＜0.05)。G2/M 期细胞在两组间差异无统计学意义。

2.5 BTG1对HK-2细胞周期的影响

见图 7、8。

图7 HK-2转染BTG1抑制剂后细胞周期柱形图Fig 7 The column chart of cell cycle after HK-2 transfected of BTG1 inhibitor and negative control

图7、8显示，HK-2细胞中转染BTG1抑制剂后，G0/G1期细胞减少(分别为 34.64% ±0.88%与51.17% ±1.84%，P ＜0.01)，S 期细胞增多(分别为58.70% ±1.17%与 32.33% ±0.23%，P ＜0.01)，G2/M期细胞增多(分别为6.33% ±1.44%与16.49% ±2.07%，P ＜0.01)。

3 讨 论

肾癌是世界上十大常见肿瘤之一，2012年美国肾癌新发病人64 770人，死亡患者13 570人，较2011年均有所增加［4］。虽然技术的进步，尤其是影像技术的进步，使得肾癌能够更早的发现，但是仍然有20% ～30%的患者被发现时肿瘤已经出现了转移［5］，并且约有20%接受手术的患者在手术后会出现复发和转移［6］。所以，明确肾癌的发病原因，为寻找有力的治疗方案提供理论支持一直是国内外研究的热点。本实验以明确BTG1基因对HK-2及786-O细胞周期及细胞凋亡的影响为主要研究目的。

图8 HK-2转染BTG1抑制剂后细胞周期流式图Fig 8 The chart of cell cycle after HK-2 transfected of BTG1 inhibitor and negative control examined by FACS

BTG1属于BTG/TOB家族，最早发现于淋巴细胞白血病。BTG1基因位于12q22染色体，mRNA全长1.8 kb，在G0/G1期细胞中高表达，在S/M期细胞中低表达。BTG/TOB家族由6编码蛋白的分子质量为19 kD，在 G0/G1期细种抗增殖蛋白组成(BTG1、BTG2/PC3/Tis21、 BTG3/Ana、 BTG4/PC3B、 TOB/TOB1、TOB2)，其主要结构特征是在N'端有104～106个高度同源性的氨基酸，这个同源区域包括两个保守的同源区A盒和B盒［7］。A盒主要有抗增殖作用，B盒主要有与靶分子结合的功能［8］。

研究发现，BTG1能够抑制NIH3T3细胞［9］和骨细胞［10］的增殖，促进乳腺癌［11］及 MCF-7 细胞［12］的凋亡。在本研究中，我们观察到高表达BTG1能够促进786-O细胞凋亡，低表达BTG1能够抑制HK-2细胞凋亡。但是BTG1的具体作用途径尚不明了。已有研究表明，BTG1的促凋亡作用可能与P53介导的NF-κB的调控有关。也有研究表明可能是BTG1参与了DNA的甲基化，进而诱导了细胞的凋亡。Nahta等［13］则证明，BTG1通过Bcl-2的负调控诱导乳腺癌细胞的凋亡。BTG1还通过与JAK/STAT1中的LPS、IFN-γ作用促进肿瘤细胞的凋亡［14］。

肿瘤的增长与细胞的增殖密切相关。研究发现，BTG2和TOB1的抗增殖作用是通过其与Caf1a/Caf1b脱腺苷酶的相互作用实现的［12］。而细胞的增殖也与细胞分裂速度、凋亡等有着密切的关系。细胞分裂速度减慢将明显降低肿瘤的生长速度。我们的研究表明，BTG1能够将细胞阻滞在G0/G1期，阻止细胞的分裂。

综上所述，我们发现 BTG1能够调节786-O及HK-2细胞的凋亡及细胞周期。可能通过这两方面，影响细胞增殖等生物行为。但其具体机制仍需要我们进一步研究。同时，BTG1的具体作用途径尚不明了，需要我们进一步明确。

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