孙彦欣，左玉柱，李建辉，范京惠，裴丽华，杨 震，王晨枫

（河北农业大学动物科技学院，河北保定 071001）

猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）主要引起初产母猪的繁殖障碍。PPV除单独感染猪外，该病毒与猪圆环病毒（Porcine circovirus type 2，PCV2）的混合感染更为普遍，给养猪业造成了严重的经济损失。核衣壳蛋白VP2是PPV的主要保护性抗原，而且具有保守性[1-4]。

PCV2是目前发现最小的动物病毒。Stevenson等研究表明，位于ORF1内201位～220位氨基酸的多肽P21为免疫优势T细胞表位，免疫动物后，动物体内的淋巴细胞明显增多，而且免疫动物血清中PCV2特异的抗体水平亦明显升高[5]。Mahe等研究结果显示，位于ORF1内185位～211位氨基酸的多肽P4（与P21共享201位～211位氨基酸）内存在一个B细胞表位[6]。以上结果提示，多肽P21内存在PCV2特异的优势抗原表位，为研制抗原表位疫苗的优势目标表位。本实验通过在PPV主要保护性抗原VP2基因上游插入PCV2多肽P21基因并构建真核重组质粒，免疫小鼠后观察PPV VP2基因疫苗免疫效力，为研制高效、新型核酸疫苗提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 HEK293T细胞购自中国细胞典型培养物中心；6周龄～8周龄雌性BALB/c小鼠购自河北医科大学实验动物中心；TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、pMD18-T载体、DL2000 DNA Marker等均购自TaKaRa公司；预染蛋白Marker购自北京全式金生物技术有限公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为天根生化科技有限公司产品；HRP标记的羊抗鼠IgG（HRP-IgG）购自Promega公司；感受态E.coliDH5α、pcDNA3.1（+）载体由本实验室保存；PPV、PCV2株由本实验室从河北省部分地区患猪体内分离获得。

1.2 VP2基因引物的设计与片段扩增 采用引物YVP2：5'-TCTGGATCCATGAGTGAAAATGTGGAA C-3'（BamHⅠ）和 ZVP2：5'-AGTCTCGAGTGATTAA CCAAGTAACTGA-3'（XhoⅠ）扩增VP2基因，反应条件为：95℃ 5 min；……