程阔菊，黄 河，杜智勇，李 洪，杨天德

（第三军医大学新桥医院麻醉科，重庆 400037）

各种基因敲除及转基因小鼠已广泛应用于心血管疾病动物模型的建立，已为心血管疾病机制的研究作出了巨大贡献。体外心肌细胞培养作为一种体外实验研究模型，可以排除神经、体液的干扰而独立地从细胞和分子水平研究心血管疾病的发生、发展机制，但由于小鼠心肌细胞的分离和培养比较困难，所以一直限制了医学科研工作者在细胞生物学水平上对心血管疾病方面的深入研究。本实验室在以往的经验基础上，摸索出了一套成熟可行、简单可靠的小鼠心肌细胞培养方法，获得的心肌细胞存活率高且纯度高。本文对此培养方法做一简单介绍，并对其中的关键影响因素做详细的探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 1～3d龄野生型C57新生乳鼠，SPF级，由第三军医大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（渝）2007－0003。

1.1.2 主要仪器与试剂 显微眼用镊、眼科剪、显微镊、显微剪（上海医疗器械有限公司），器械使用前清洗干净并经高压灭菌（121℃，20min）。二氧化碳培养箱、倒置显微镜（OLYMPUS）、超净工作台（苏净安泰）、低温台式离心机（Sigma）。小牛血清、DMEM／F12、胰酶、胶原酶Ⅱ（GIBCO），BrdU－溴脱氧尿苷（Sigma），青霉素、链霉素（华美生物工程公司），anti－α－actinin（Millipore），组织固定液（Alphelys），Triton X－100（Amresco），SlowFade Gold antifade reagent with DAPI（Invitrogen），Alexa goat anti－mouse IgG（H＋L）（Invitrogen）。

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞培养方法 乳鼠75%乙醇全身消毒，眼科剪沿剑突处正中线开胸，轻轻挤出心脏，迅速用弯显微镊取下心脏，放入盛有冷DMEM／F12培养液的平皿中。用眼科剪剪掉两心耳，轻柔清洗残留血液后心脏转入另一盛有冷DMEM／F12培养液的培养皿中，将心脏均匀剪成约1mm3的碎片。……