张 进

（上海化学工业区医疗中心 200000）

中国是乙型病毒肝炎（HBsAg）的高发国家，根据流行病学调查，人群发生率较高。表面抗原携带率约为15%［1］。乙型肝炎的实验诊断对于其治疗及预防有重要参考意义。目前，中国大多数临床实验室都采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法来检测HBsAg，而检测样品大多数均为血清。抽取静脉血检验，受检者痛苦，且操作步骤繁琐，费时费力，存在一定风险，并不利于乙型肝炎疾病长期临床的检验监测。有相关研究报道，唾液中可以检测到乙型肝炎病毒［2］。然而，国内并没有特别针对唾液样品的商品化试剂盒。虽国内有相关研究报道，但方法条件不一，且特异度和敏感度均偏低。因此，本研究以唾液为样品，对ELISA条件进行优化，并对改进后的方法进行评价。

1 资料与方法

1.1 一般资料 47例HBsAg血清阳性样本均来自本院住院和门诊患者，其中，男27例，女20例，年龄18～67岁，平均（40±12）岁。HBsAg血清阴性健康对照68例，均为来本院健康体检人员，其中，男36例，女32例，年龄22～56岁，平均（38±8）岁，无乙型肝炎病毒感染史。所有患者均签署知情同意书。

1.2 试剂 购自上海科华公司，均在有效期内使用。

1.3 取样 受检者静脉采血2mL，分离血清，存于－20℃待检。同时嘱被检者随机吐唾液3mL，存于－20℃待检。

1.4 检测方法 血清检测具体方法严格按上海科华公司提供的说明书进行。唾液检测具体方法除以下几点外，均按说明书进行，（1）样品类型：①未处理样本，1mL唾液样本直接用于检测；②样本上清，将2mL唾液样本12 000r／min离心5min取上清；③样本沉淀，将上述离心后的沉淀用2mL蒸馏水重悬。（2）加样体积：50、100、150μL。（3）样品孵育条件：37 ℃，90 min；25℃，18h。

1.5 临界值（cut－off value，CO）计算方法 方法1：CO1＝阴性对照OD450均值／3；方法2：CO2＝阴性对照 OD450均值＋3SD；方法3：使用 MedCalc统计软件（version 9.2.1.0），利用ROC曲线计算曲线下面积（AUROC），判断最优临界值CO3。

1.6 统计学处理 血清样品的HBsAg检测结果作为评价优化后ELISA方法用于检测唾液样品HBsAg的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值的标准。计量资料采用表示，绝对变量比较采用χ2检验；非绝对变量比较采用 Mann－Whitney U检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。唾液和血清检测结果的一致性用κ指数评估。

2 结 果

阳性血清样品的平均吸光值（OD450）为2.274±1.453，阴性血清样品的平均吸光值（OD450）为0.017±0.026。未处理样本、样本上清和样本沉淀这3种不同类型的样品检测结果比较差异无统计学意义（P＝0.100），结果如图1所示。因此，不做任何处理的唾液样品可直接用于检测。不同加样体积检测结果比较差异无统计学意义（P＝0.070），结果如图2所示。因此，加样体积定为50μL。对50μL不做处理的唾液样品在2种ELISA孵育条件（温度、时间）下的检测结果进行分析，发现25℃孵育18h条件下的检测结果与对应血清检测结果极为相似，而37℃孵育2h条件下的检测结果与血清检测结果差异显著（P＝0.003），见图3。

图1 未处理样本、样本上清和样本沉淀的检测结果

由于目前暂无用于检测唾液中HBsAg的商业化试剂盒，且唾液检测在国内医院中并不常用，所以临界值（cut－off value）的计算并没有标准方法。因此，通过对3种不同的临界值计算方法进行评估，结果显示ROC法（CO3）最合适，临界值为0.098。采用该方法后，精确度、阳性预测值和阴性预测值均得到提高，分别达到93.0%、89.9%和95.4%，结果见表1。

根据以上实验结果，选取50μL不做任何处理的唾液样品，采用25℃孵育18h的孵育条件进行检测，结果按照ROC曲线法判定。通过上述优化后的ELLSA方法检测，47例血清阳性对应的唾液样品中，44例为阳性；68例血清阴性对应的唾液样品中，63例为阴性。该优化方法检测唾液中HBsAg结果与对应血清样品结果见图4。总之，血清和唾液样品检测结果的一致性比较高，κ指数为0.87。且该方法的特异度和敏感度分别为92.6%和93.6%。

图2 3种不同加样体积的检测结果

图3 37℃孵育2h和25℃孵育18h两种孵育条件处理的检测结果

表1 3种临界值计算方法的敏感度、精确度、阳性预测值、阴性预测值和精确度

图4 优化后ELISA法检测唾液中HBsAg结果与对应血清样品结果比较

3 讨 论

唾液用于多种传染病的抗体或抗原检测具有方便性。有报道显示，HBV携带者的唾液可能具有潜在的传染性［3］。近年来有大量研究致力于唾液中肝炎病毒标志物检测方法的开发和优化［4－6］。唾液取样具有简单、快捷、低成本等优点。因此，在部分血清流行病学检测中，唾液取代血清作为检测样品将产生巨大的社会效益和经济效益［7］。本研究主要对ELISA检测唾液中乙型肝炎表面抗原的方法进行了优化和评价。研究中发现，个别唾液检测结果为阴性的样品，对应的血清检测结果却为阳性。这可能是由于该唾液样品中HBV抗原浓度太低的原因。同时，作者还发现这些阳性血清样品中HBsAg浓度很高（OD450＞3.0），表明唾液中 HBsAg浓度与血清中HBsAg浓度之间并无显著相关性，该原因仍需进一步研究。

由于目前暂无用于检测唾液中HBsAg的商业化试剂盒，且唾液检测在国内医院中并不常用，所以临界值（cut－off value）的计算并没有标准方法。3种不同的临界值计算方法在其他研究中均有成功的报道［8－11］。因此，本研究对此3种方法进行评价，结果显示AUROC分析法最为合理，可得到较高的敏感度和特异度。通过对其他条件（样品类型、加样体积、孵育温度和时间）进行优化，最终使该方法的精确度达到93%。

［1］ 王萍.中国乙型肝炎的流行及疫苗研究［J］.医学动物防治，2012，28（8）：872－874.

［2］ 吴晓蔓，冯秀兰，周利纯.乙肝病毒携带产妇乳汁、唾液乙肝病毒标志物检测结果分析［J］.中国妇幼保健，2009，24（8）：1036－1038.

［3］ 张健，窦翠云，李晓哲，等.乙型肝炎患者唾液中HBV－M与HBV DNA的相关性研究［J］.中国误诊学杂志，2007，7（2）：209－211.

［4］ Heiberg IL，Hoegh M，Ladelund S，et al.Hepatitis B virus DNA in saliva from children with chronic hepatitis B infection：implications for saliva as a potential mode of horizontal transmission［J］.Pediatr Infect Dis J，2010，29（5）：465－467.

［5］ Hutse V，Verhaegen E，De Cock L，et al.Oral fluid as a medium for the detection of Hepatitis B surface antigen［J］.J Med Virol，2005，77（1）：53－56.

［6］ Amado LA，Villar LM，De Paula VS，et al.Comparison between serum and saliva for the detection of hepatitis A virus RNA［J］.J Virol Methods，2008，148（1／2）：74－80.

［7］ 黄晨艳，方衣兵，蔡娟，等.围生期产妇血清、乳汁、唾液乙肝病毒标志物间的关联性［J］.中国妇幼保健，2006，26（26）：4081－4084.

［8］Judd A，Parry J，Hickman M，et al.Evaluation of a modified commercial assay in detecting antibody to hepatitis C virus in oral fluids and dried blood spots［J］.J Med Virol，2003，71（1）：49－55.

［9］ Cruz HM，da Silva EF，Villela－Nogueira CA，et al.Evaluation of saliva specimens as an alternative sampling method to detect hepatitis B surface antigen［J］.J Clin Lab Anal，2011，25（2）：134－141.

［10］Ljungdahl M，Montgomerie C，Gyan BA，et al.Screening for HIV and hepatitis C virus using saliva tests in a prison in Ghana.a study of the prevalence and the status of knowledge［J］.Lakartidningen，2012，109（4）：161－163.

［11］Arora G，Sheikh S，Pallagatti S，et al.Saliva as a tool in the detection of hepatitis B surface antigen in patients［J］.Compend Contin Educ Dent，2012，33（3）：174－176.