张广钰，钟 漓，田小林，戴 凌，朱袭嘉，蒋志庆

（桂林医学院附属医院胃肠外科，广西 桂林 541001）

结肠癌是临床上常见的消化道恶性肿瘤，其发生、发展是多基因相关、多步骤的，寻找结肠癌发生、发展的诱导和促进基因，为结肠癌的诊断、治疗及其预后提供理论支持［1］。成为关注热点的microRNA作为一种非编码小分子RNA，具有广泛调节基因表达的功能，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种重要细胞活动的调控［2］。近年来，研究发现microRNA具有癌基因和抑癌基因的作用，从而参与肿瘤的发生、发展［3－4］。本文通过逆转录实时荧光定量聚合酶链反应（real－time reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－qPCR）检测38例结肠癌中microRNA－144的表达水平，探讨其与结肠癌及其临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 桂林医学院2011年6月至2012年4月实施手术治疗的结肠癌患者38例，其中，男21例，女17例，患者中位年龄59岁，术前未行放、化疗等治疗，组织病理类型的判断标准参照WHO病理分期标准。每例标本留取肿瘤组织及对应7cm以上的癌旁正常结肠黏膜组织，每例都经病理切片检查证实，离体后5min内置于液氮中保存。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；逆转录酶、RNA酶抑制剂、Oligo dT、dNTPs、SYBR Mastermix等购自Takara公司；引物由上海Invitrogen生物技术有限公司合成。

1.2 RNA提取 取液氮保存的结肠癌组织及癌旁正常结肠黏膜组织标本，在液氮中碾碎至粉末，加1mL Trizol裂解10 min收集上清液于EP管中，加氯仿200μL充分混匀，12 000 r／min离心15min，取上清200μL转移到新的去RNA酶的EP管中，加等量异丙醇颠倒混匀放置10min，12 000r／min离心10min，弃上清液加1mL 70%的乙醇颠倒混匀，12 000r／min离心10min，弃去乙醇，干燥，用DEPC处理过的蒸馏水溶解。采用日本Malcom极微量光谱光度计e－spect测所提RNA浓度，OD 260／280在1.8～2.0之间的用于检测。

1.3 RT－qPCR体系及其反应条件 表1为所用逆转引物的序列。按所用逆转录试剂盒说明书20μL的体系，1μg RNA模板分别以microRNA－144和U6（作为内参，分析microRNA－144的表达）引物进行逆转录，反应条件：42℃60min。取样进行qPCR，反应体系：1μL RT产物（终浓度为5ng）、2＊SYBR Green I Mastermix 12.5μL、0.5μmol／L microRNA 特异前向引物、0.5μmol／L通用的反向引物，所有样品做3个复孔。反应条件：95℃7min后，95℃15s，60℃30s，40个循环。其余cDNA存放于－80℃超低温冰箱。qPCR反应后随即分别取6个样品各1μL进行3%琼脂糖凝胶电泳检测目标产物（图1）。Real－time定量PCR使用的Agilent Technologies stratagene Mx3005p仪器。所得Ct值，以 U6为内参，用2－△△Ct进行分析来表示microRNA－144癌组织相对于癌旁正常组织的变化倍数。

表1 microRNA－144RT－qPCR检测相关引物序列

图1 qPCR产物电泳图

1.4 统计学处理 microRNA的表达数据以中位数和95%可信区间（95%CI）表示。受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析采用SPSS13.0统计软件行非参数秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 结肠癌及其相应癌旁正常结肠黏膜组织中的microRNA－144的表达情况 qPCR结果显示，内参U6的Ct值没有明显变异，结肠癌组织中的microRNA－144的Ct值明显低于相应的癌旁正常结肠黏膜组织，表明microRNA－144在结肠癌组织中表达上调。38例结肠癌患者癌组织与癌旁正常结肠黏膜组织的 microRNA－144的相对表达量 N（N＝2－△△Ct），差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 microRNA－144在结肠癌及癌旁组织中的表达情况

2.2 结肠癌组织中microRNA－144表达与临床病理特征的关系 结肠癌组织中microRNA－144的表达与肿瘤的分化程度相关，高分化组的表达量低于中、低分化组的表达量（P＜0.05），中分化组表达量与低分化组的表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05）；结肠癌组织中 microRNA－144的表达水平与临床TNM分期有显著相关性（P＜0.05），Ⅰ～Ⅱ期结肠癌组织中microRNA－144表达量低于Ⅲ～Ⅳ期（P＜0.05）；结肠癌组织中microRNA－144的表达与淋巴结的转移情况无相关性（P＞0.05）；结肠癌组织中 microRNA－144的相对表达量与其他临床病理因素如性别、年龄、肿瘤的大小无明显相关性（P＞0.05），见表3。

2.3 采用ROC曲线分析microRNA－144评价结肠癌细胞分化程度及TNM分期的特异性和敏感性 microRNA－144比较不同分化程度的ROC曲线下面积为0.800（95%CI＝0.661～0.939，P＝0.003），比较不同TNM分期的ROC曲线下面积为0.820（95%CI＝0.675～0.965，P＝0.001），提示 microRNA－144适合作为评价细胞分化程度和结肠癌TNM分期的判断标准（图2）。以microRNA－144相对表达量1.70作为评价临界值，区分高分化结肠癌的敏感性和特异性分别为88.0%和61.5%，区分TNM分期的敏感性和特异性分别为87.5%和64.3%。

表3 结肠癌中microRNA－144表达和临床病理因素的相关性

图2 microRNA－144表达与结肠癌患者分化程度和TNM分期的ROC曲线

3 讨 论

结肠癌是世界上第3大常见肿瘤，因结肠癌导致的死亡率排名第2位，约50%的结肠癌患者在确诊时已发生远处转移，是一种恶性程度非常高的肿瘤，手术治疗依然是结肠癌的主要治疗方式之一。随着使用抗EGFR和抗VEGF的分子靶向治疗的应用及化疗的进展，晚期结肠癌患者的中位生存期已经由6个月增高至2年［5］。随着对结肠癌分子水平研究的深入，对microRNA在结肠癌的研究越来越多。

microRNA可调节30%的人类基因。成熟的microRNA一般有19～25个碱基，这些碱基与3′端非编码区的mRNA（3′UTR）结合而抑制转录进而影响基因的表达［6］。目前，已有研究证实，microRNA通过参于基因调控影响蛋白表达水平而影响结肠癌的进展，而且，不同的microRNA在结肠癌的作用不同，甚至相同的microRNA在不同类型的结肠癌中的表达也不相同，有些microRNA充当癌基因作用，有些microRNA充当抑癌基因的作用［7］。microRNA在许多肿瘤中都发现有过表达，如乳腺癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、甲状腺癌等［7］。microRNA－144在结肠癌患者的粪便和血液中高表达［8－9］，然而其在结肠癌患者组织中的表达情况国内外尚没有文献报道，因此本课题选microRNA－144作为研究对象。本研究显示，microRNA－144在结肠癌组织中的表达量明显增高，在分析microRNA－144表达与结肠癌临床病理因素的相关性中发现，microRNA－144表达水平与结肠癌组织的分化程度相关，而且与结肠癌肿瘤患者的TNM分期相关。microRNA－144在中低分化组中的表达水平高于高分化组，提示microRNA－144主要在结肠癌的进展阶段起作用，而在结肠癌的发生起始阶段可能以其他因素起作用为主。进一步的ROC曲线分析显示，microRNA－144高分化结肠癌的敏感性和特异性分别为88%和61.5%（图2）。因此，microRNA－144可以作为结肠癌肿瘤分化程度的一个辅助诊断标准。

microRNA－144可作为结肠癌肿瘤分化程度的一种辅助指标，其表达量的上调在诊断结肠癌的分化程度方面有较高的敏感性。本研究与大部分研究结果一致，目前发现有35种microRNA在结肠癌中有表达量的改变。然而，对于microRNA在肿瘤中的表达有一些截然不同的观点，有些microRNA发现与分化程度呈正相关，而同样关于该microRNA的研究则发现与分化程度呈负相关，有学者认为这主要是因为在体内的位置不同所致，也有研究发现在不同位置很少同时检测到microRNA升高［9］。本研究表明，不同的分化程度、不同的临床TNM分期均对microRNA－144产生影响。

本实验结果显示，microRNA－144在结肠癌组织中的表达量高于正常的结肠癌组织中的表达量，且随着TNM分期而发生改变，提示microRNA可作为一种肿瘤的进展指标。有学者曾作过该方面的研究，其机制为microRNA导致肿瘤癌基因或抑癌基因发生了转化［10］。但本研究对肿瘤的进展未作进一步深入研究。对microRNA作为一种临床治疗效果预测的分子标志，有许多研究曾报道［11］。本研究组目前对microRNA－144过表达患者的临床治疗效果以及预后情况正在作进一步研究。

［1］ Cho WC.OncomiRs：the discovery and progress of microRNAs in cancers［J］.Mol Cancer，2007，6：60－65.

［2］ Gabriely G，Wurdinger T，Kesari S，et al.MicroRNA 21promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators［J］.Mol Cell Biol，2008，28（17）：5369－5380.

［3］ Wang R，Wang ZX，Yang JS，et al.MicroRNA－451functions as a tumor suppressor in human non－small cell lung cancer by targeting ras－related protein 14（RAB14）［J］.Oncogene，2011，30（23）：2644－2658.

［4］ Kent OA，Chivukula RR，Mullendore M，et al.Repression of the miR－143／145cluster by oncogenic Ras initiates a tumor－promoting feed－forward pathway［J］.Genes Dev，2010，24（24）：2754－2759.

［5］ Douillard JY，Siena S，Cassidy J，et al.Randomized，phase III trial of panitumumab with infusional fluorouracil，leucovorin，and oxaliplatin（FOLFOX4）versus FOLFOX4alone as first－line treatment in patients with previously untreated metastatic colorectal cancer：the PRIME study［J］.J Clin Oncol，2010，28（31）：4697－4705.

［6］ Lee I，Ajay SS，Yook JI，et al.New class of microRNA targets containing simultaneous 5′－UTR and 3′－UTR interaction sites［J］.Genome Res，2009，19（7）：1175－1183.

［7］ Slaby O，Svoboda M，Michalek J，et al.MicroRNAs in colorectal cancer：translation of molecular biology into clinical application［J］.Mol Cancer，2009，8：102－115.

［8］ Kalimutho M，Del VBG，Di Cecilia S，et al.Differential expression of miR－144as a novel fecal－based diagnostic marker for colorectal cancer［J］.J Gastroenterol，2011，46（12）：1391－1402.

［9］ Slattery ML，Wolff E，Hoffman MD，et al.MicroRNAs and colon and rectal cancer：differential expression by tumor location and subtype［J］.Genes Chromosomes Cancer，2011，50（3）：196－206.

［10］Schepeler T，Reinert JT，Ostenfeld MS，et al.Diagnostic and prognostic microRNAs in stage II colon cancer［J］.Cancer Res，2008，68（15）：6416－6424.

［11］Hummel R，Hussey DJ，Haier J.MicroRNAs：predictors and modifiers of chemo－and radiotherapy in different tumour types［J］.Eur J Cancer，2010，46（2）：298－311.