李凤伟,刘 娟,王 超

(佳木斯大学药学院,黑龙江 佳木斯 154007)

黑龙江林蛙(Rana amurensis Boulenger),又名哈士蟆、臭迷子、雪蛤。隶属两栖纲 Amphibia,无尾目 Anura,参差型亚目 Diplasiocoela,蛙科 Ranidae,蛙亚科 Raninae,林蛙属Rana[1]。大多数标本上眼睑有一黑斑,从两眼之间至肛门上方有一条宽阔的灰白色或灰色略带蓝色的脊中线,鼓膜部位有三角形黑色斑[2]。

近年来对黑龙江林蛙的研究主要集中在养殖、食用、物种保护以及环境污染等方面,而从药用角度对黑龙江林蛙的研究较少[3～6]。超声技术是近年来普遍用于中药材有效成分提取的方法[7],它能够加速目标成分进入溶剂,从而很大程度的提高了提取效率,节约了溶剂。本文首次采用超声法对黑龙江林蛙卵中多糖的提取工艺进行研究,考察超声波在黑龙江林蛙卵多糖的提取中应用的可行性,为建立快速、经济、高效的黑龙江林蛙卵多糖提取方法提供基础数据,为后续黑龙江林蛙卵多糖的进一步开发提供可靠的理论依据。

1 材料与仪器

黑龙江林蛙9月份捕捉于佳木斯地区,经佳木斯大学生药学教研室刘娟教授鉴定为蛙科林蛙属黑龙江林蛙,黑龙江林蛙及卵标本保存于佳木斯大学生药学研究室。将蛙解剖,卵取出后阴干,粉碎后密封保存。

HH-2.4型恒温水浴锅(郑州长城科工贸有限公司),KQ5200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),SHB-Ⅲ循环水式真空泵(郑州长城科工贸有限公司),电子天平(上海恒平科学仪器有限公司),紫外-可见分光光度计 (上海棱光技术有限公司),80-2型离心机(上海浦东物理光学仪器厂)。

苯酚,浓硫酸,石油醚,无水乙醇,氯仿,正丁醇等试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 多糖提取工艺流程

黑龙江林蛙卵粉末→石油醚回流6h,除去脂溶性杂质→按比例加入蒸馏水,热水浴一定时间→超声 (超声功率160W)→抽滤→取滤液,加入 1倍量的无水乙醇沉淀过夜→3000r/min离心 15min→蒸馏水溶解沉淀 ,定容至 50mL容量瓶中→Sevage试剂除蛋白→得多糖溶液。

2.2 黑龙江林蛙卵多糖含量的检测方法

2.2.1 标准曲线的制作[8]

取 105℃干燥至恒重的葡萄糖 10mg,加水溶解,定容至100mL容量瓶中,配成浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别从葡萄糖标准溶液中准确移取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL置于干燥的试管中 ,分别加水补至各溶液总量为2.0mL,再加入1.0mL 5%的苯酚溶液,摇匀 ,然后迅速加入5.0mL的浓硫酸,充分混匀 ,室温冷却15min后 ,40℃水浴10min,取出流水冷却。以加入2.0mL蒸馏水的溶液作为空白,在490nm波长处测定吸光度值。以葡萄糖含量(μ g)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制吸光度-葡萄糖含量的关系曲线,见图1。

图1 葡萄糖

2.2.2 样品多糖的含量测定

取多糖溶液2.0mL加入1.0mL5%的苯酚溶液,摇匀,再迅速加入5.0mL的浓硫酸,充分混匀,室温冷却15min后,40℃水浴10min,取出流水冷却。以加入2.0mL蒸馏水的溶液作为空白,在490nm波长处测定吸光度值,以标准曲线方程计算,再乘以校正系数0.9得黑龙江林蛙卵多糖的含量。

2.3 黑龙江林蛙卵多糖提取工艺的单因素实验

黑龙江林蛙卵多糖提取工艺的四个因素:超声时间、料液比、超声前加热时间、超声温度。各因素的水平分别为:超声 时 间:10、 20、30、 40、 50min;料 液 比:1:10、 1:20、 1:30、1:40、1:50;超声前加热时间:10、 20、 30、40、 50min;超声 温度:58、68、78、 88、98℃。每个因子设计 3个重复性实验 ,取平均值作为实验参数,确定各因素对多糖含量的影响。

2.4 黑龙江林蛙卵多糖提取工艺的正交实验

以多糖含量为指标,在上述单因素实验的基础上,选择超声时间 (A)、料液比 (B)、超声前加热时间 (C)、超声温度(D)四个因素进行正交试验,采用 L9(34)正交试验表进行实验,各因素水平见表1。

表1 正交实验因素水平表

图2 超声时间对多醣含量的影响

3 结果与分析

3.1 单因素实验

3.1.1 超声时间对蛙卵多糖提取的影响

由图2可知,随着超声时间的延长,蛙卵多糖的含量先升后降。10～20min时增加幅度最大,20min后多糖含量迅速下降。可能是由于随着超声时间的延长多糖的结构被破坏,导致含量下降。超声20min时达到最大,为625.7mg/100g。

3.1.2 料液比对蛙卵多糖提取的影响

由图3可知,随着料液比的增大 ,蛙卵多糖的含量总体呈上升趋势。可能是由于随着料液比的增大,蛙卵细胞内和细胞外的多糖浓度梯度增大,加快了多糖的溶出。当料液比为1:50时 ,多糖含量达到最大值,为217.7mg/100g。

图3 料液比对多醣含量的影响

3.1.3 超声前加热时间对蛙卵多糖提取的影响

由图 4可知 ,超声前加热时间在10～40min范围时,对多糖含量的影响不大,同时多糖含量也较低。在 40～50 min时多糖含量增加幅度较快,50min时达到最大,为122.3mg/100g。可能是由于多糖的溶出与蛙卵外包裹的胶状物有关,40min之前胶状物的溶解较少,且也较慢,阻止了多糖的溶出,而在40min之后胶状物的溶解加快,同时多糖的溶出量也迅速增加。

3.1.4 超声温度对蛙卵多糖提取的影响

由图 5可知,多糖含量在超声温度为58～88℃范围内时,呈下降的趋势;在 88～ 98℃范围内,呈上升趋势,但升高幅度不大。可能是由于在超声波中多糖易分解,温度升高会加快多糖的分解速度,因此导致了超声温度升高多糖含量下降的问题。在超声温度为58℃时多糖含量最高,为 610.7mg/100g。

3.2 正交试验

由表2可知,各实验因素对黑龙江林蛙卵多糖含量影响的大小顺序为:D＞B＞A＞ C,因此超声温度对蛙卵多糖含量的影响最大,其次是料液比和超声时间,超声前加热时间影响较小。确定黑龙江林蛙卵多糖最佳提取工艺条件为A1B2C3D2,即超声时间 10min,料液比1:40g/mL,超声前加热时间50min,超声温度68℃。

表2 正交试验结果与极差分析

4 结论

本实验为首次对未成熟的黑龙江林蛙卵中的粗多糖进行研究,所采用的超声法提取蛙卵粗多糖的最佳工艺参数为:超声时间 10min,料液比1:40g/mL,超声前加热时间50min,超声温度68℃。该方法具有溶剂用量少,成本低;操作简单方便;提取时间短,节能等优点。应用该方法,采用优化的工艺条件可获得纯度较高的蛙卵多糖,为黑龙江林蛙卵多糖的进一步研究奠定基础。

[1]费梁,叶昌媛,黄永昭,等.中国两栖动物检索及图解 [M].四川:四川科学技术出版社,2005

[2]赵文阁.黑龙江省两栖爬行动物志 [M].北京:科学出版社,2008

[3]武廷华.黑龙江林蛙的生物学特性及饲养 [J].特种经济动植物,2007,8-9

[4]刘晓丹,郑明珠,刘景圣.响应面法优化碱法提取林蛙卵团中粗多糖的工艺研究 [J].食品科学,2010,31(22):96-100

[5]吴文英,李丕鹏,陆宇燕,等.黑龙江林蛙繁殖期两性皮肤组织结构的差异比较 [J].野生动物,2011,32(3):141-145

[6]李淑兰,刘超,吕晓慧,等.黑龙江林蛙冬眠和非冬眠消化道内分泌细胞的比较研究[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2010,19(3):245-249

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