张东东,扈清云,王培军,欧叶涛,韩 曦,陈乃峰,尹兴忠,钟堂武,梁衍锋

(佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯 154007)

膀胱癌是一种最常见的原发于膀胱上皮细胞的泌尿系统恶性肿瘤,其恶性程度和复发率较高。通过研究发现导致膀胱癌的原因有很多,其中基因和生活环境尤为主要。通过以往的研究发现当膀胱细胞内一个或多个抗癌基因的失活或癌基因的激活膀胱癌的发生主要因素。因此,我们通过分子遗传学研究膀胱癌不仅有助于膀胱癌的发病机制及膀胱肿瘤基因的研究,而且对膀胱肿瘤的诊断及预后均有着十分重要的指导意义。本实验主要研究的是 EphA2(erythropoietin producing hepatoma cell line A2),EphA2是 EphA亚家族受体8个成员中的第2个[1,2]。在人的多种细胞系或组织中都有 EphA2表达。人类 EphA2基因位于染色体1p36.1上,其含有 17个外显子。EphA2能够调节细胞增生主要体现在:EphA2的过度表达时能使正常细胞发生变异[3],正常情况下当 EphA2与配体结合后,削弱诱导细胞生长的生长因子活性,从而抑制了细胞的生长。因此当 EphA2正常表达时可抑制细胞发生增生,异常表达时则可以促进细胞转化。本次实验采用免疫组织化学法和 RT-PCR法检测正常膀胱组织与膀胱癌组织中的 EphA2异常表达率,通过本次试验分析正常膀胱组织和膀胱癌组织中 EphA2表达,观察蛋白水平和基因水平表达的相互关系,能为膀胱癌在其发病、诊断治疗以及临床预后提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验材料来自于佳木斯大学附属第一医院,其中正常膀胱组织新鲜的10例,膀胱癌组织新鲜的31例,此外还有膀胱癌石蜡组织标本40例。

1.2 实验试剂

琼脂糖,DEPC液,枸橼酸缓冲液,DAB显色试剂盒,兔抗人 EphA2多克隆抗体,2000bpMarker,PBS缓冲液,Taq DN A聚合酶,引物,Trizol,GAPDH,SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),RNA提取试剂盒(上海生工生物工程技术有限公司),反转录试剂盒 (宝生物工程(大连)有限公司)等。

1.3 实验方法

1.3.1 1RT-PCR法:实验前将所有使用器具用浓硫酸和DEPC水浸泡,高温高压消毒,烘干保存。

1.3.2 提取正常膀胱组织和膀胱癌组织的 RN A并检测:首先使用匀浆器将癌组织和正常膀胱组织进行匀浆处理,其次将匀浆后的组织加入提取液离心,最后加 RNA抑制酶离心后保存。使用凝胶电泳检测提取的 RN A是否完整。

1.3.3 反转录:将提取到的 mRN A进行反转录得到相应的cDN A并对其扩增。

1.3.4 RT-PCR:制备标准曲线,进行琼脂糖凝胶电泳。

1.3.5 将 RT-PCR实验所得凝胶利用天能 GIS凝胶图像处理系统对进行分析,得出数据。

1.4 免疫组化(SABC)法

本实验标本包括新鲜组织标本和膀胱癌石蜡组织标本,先将新鲜组织标本进行固定后脱水形成石蜡标本。将所有石蜡组织切片常规免疫组化处理加入兔抗人 EphA2多克隆抗体封片计数。

1.5 统计学处理

利用 SPSS16.0软件对所得出的数据进行 t检验和卡方检验,P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR法 EphA2的检测

通过 RT-PCR法检测发现 EphA2在膀胱癌组织中的表达明显高于正常膀胱组织的表达。

表1 RT-PCR法检测 Eph A2在正常膀胱组织和膀胱癌组织的表达

2.2 免疫组化 EphA2的检测

EphA2免疫组化阳性物质呈棕黄色,EphA2免疫染色定位在膀胱细胞膜和细胞浆,在正常膀胱黏膜上皮中,EphA2呈阴性或弱阳性表达。而当膀胱发生癌症病变时会随着癌症的分化高低的不同而改变。分化越高表达越低,分化越低表达越高。通过免疫组化法发现在膀胱癌组织中 EphA2的异常率表达为77.46%(55/71),正常膀胱黏膜组织异常率的表达为20%,EphA2在膀胱癌组织中的异常表达率明显高于正常组织 (P ＜ 0.01)。

表2 免疫组化(SABC)法分析 EphA2在正常膀胱组织和膀胱癌组织的表达

3 讨论

在研究发现 EphA2对细胞的增生具有一定的调节作用[4,5]。通过在蛋白水平研究表明 EphA2在膀胱移行细胞癌中发现:当 EphA2在正常表达情况下可抑制细胞增生,而异常表达时可以促进细胞的转化。本实验采用 RT-PCR法以及免疫组织化学技术,检测了71例膀胱移行细胞癌和10例正常膀胱组织的 EphA2的表达情况发现:在基因水平上膀胱移行细胞癌的 EphA2表达高于正常膀胱组织中的 EphA2表达,利用免疫组织化学方法蛋白检测膀胱移行细胞癌的EphA2表达高于正常膀胱组织中的 EphA2表达,两种检测方法得出的结论一致。本研究得到:在膀胱移行细胞癌中EphA2的基因与蛋白有着重要的联系,EphA2的基因决定了EphA2蛋白的表达。这一结果提示 EphA2在膀胱癌的发生、发展过程中起着十分重要的作用,从而为膀胱癌的发生、诊断和治疗等提供基础理论依据。

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