佟丽波,王 晶,王春敏,朱贵明,姚海涛,卢北燕,佟秀凤,张 燕

(1.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003;2.佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯 154007)

子宫内膜癌是妇科最重要的恶性肿瘤之一,在西方发达国家其发病率居女性生殖器官恶性肿瘤的第一位。近年来中国子宫内膜癌的发病率也有明显上升的趋势,通过对子宫内膜癌的发生、发展机制的认识可以从根本上提高其预防诊断和治疗水平[1]。上皮型钙黏蛋白-E是细胞间黏附分子的重要成员,不光介导细胞之间的黏附,而且细胞的信号转导也可直接参与。对肿瘤的发生、发展、浸润和转移相关[2]。KLK7基因近年来研究发现在人体许多组织和器官中均有表达,而且和多种肿瘤的生长、发展、浸润相关。本实验通过检测重组人激肽释放酶7蛋白和 E-钙黏蛋白在增生期子宫内膜、子宫内膜不典型增生、子宫内膜癌中的表达情况,探讨研究其表达与子宫内膜癌的关系及临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料来源及分组

收集佳木斯大学附属第一医院病理科存档蜡块(2007～

2012年 )均为在本院第一次手术,术前未进行放、化疗治疗,将实验分为3组。Ι组:子宫内膜不典型增生30例,子宫切除术后病理诊断为子宫内膜不典型增生中度-重度。年龄36～55岁,平均 47.5岁。Ⅱ组:子宫内膜癌组 35例,子宫切除术后经病理诊断为子宫内膜腺癌,其中浸润浅肌层为16例,浸润深肌层为9例。年龄35～ 74岁,平均 57.3岁。Ⅲ 组:对照组16例,门诊行诊断性刮宫术,术后病理诊断为功血 ,均为增生期。术前均未用过性激素类药物治疗。年龄25～ 48岁,平均41.2岁。以上实验标本均由病理科医师证实。

1.2 主要试剂

免抗人 KLK7多克隆抗体(北京博奥森公司),免抗 E-cad多克隆抗体 (福州迈新生物技术开发有限公司),DAB显色试剂盒(福州迈新公司),SP免疫组化试剂盒 (福州迈新公司)。

1.3 实验方法

(1)将固定于福尔马林中的标本进行烤片,68℃烘烤20min。(2)常规二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水。(3)阻断 灭活内源性过氧化物酶。(4)将柠檬酸钠缓冲液置于容器后放入组织,加热冷却2次。(5)用 PBS冲洗血清封闭、孵育。(6)滴加按照试剂盒说明书操作,KLK7抗体工作液稀释比例为1:100,E-cad抗体工作液稀释比例为 1:200。4℃过夜。(7)PBS冲洗三次。(8)滴入二抗,孵育。(9)加入 DAB显色剂。(10)封片。

1.4 结果判定

KLK7蛋白为细胞浆或细胞膜表达,呈棕黄色着色为阳性表达。E-cad蛋白为细胞膜表达,呈棕黄色着色为阳性表达。按照细胞阳性着色程度(抗原含量 )可分为:细胞无显著着色者为()记0分,浅黄色弱阳性者为()记1分,棕黄色中等阳性者为)记 2分,棕褐色强阳性者为)记3分;按照阳性细胞数量可分为:弱阳性(指阳性细胞数占总细胞数25%以下)者(),中等阳性(指阳性细胞数占总细胞数25%～ 49%)者(),强阳性 (指阳性细胞数占总细胞数50%以上 )()。应用积分综合计量。计算公式:()%×0+()%× 1+ ()%×2+()%× 3:;总数值 ＜1.0者为(+),1.0～1.5者为 (),＞ 1.5者为 ()。

1.5 统计学处理

所得的全部数据采用 SPSS16.0统计软件,进行i2检验,以P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 KLK7蛋白在正常组、子宫内膜不典型增生及子宫内膜癌中的表达:正常组为12.5%,在子宫内膜不典型性增生组为 85%,在子宫内膜癌中的表达为92%。与正常组比较,子宫内膜不典型性增生组升高 ,有统计学意义 (P＜0.05)。正常组与子宫内膜癌比较,KLK7蛋白的阳性表达率显著增高(P ＜ 0.05)。见表 1。

表1 KLK7蛋白子宫内膜癌中的表达

2.2 E-cad蛋白在正常组、子宫内膜不典型增生及子宫内膜癌中的表达:正常组为81.25%,在子宫内膜不典型性增生组为 65%,在子宫内膜癌中的表达为44%。与正常组比较,子宫内膜不典型性增生组升高 ,有统计学意义 (P＜0.05)。正常组与子宫内膜癌比较,E-cad蛋白的阳性表达率显著增高(P ＜ 0.05)。见表 2。

表2 E-cad蛋白子宫内膜癌中的表达

3 讨论

子宫内膜癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,多发于围绝经期女性和绝经后女性,是导致死亡的仅次于卵巢癌和宫颈癌的第三名妇科恶性肿瘤[3]。目前发病率有逐年升高的趋势。研究发现其发病与生活方式关系密切,不同地域发病率不同,在北美和欧洲发病率高居女性生殖系统恶性肿瘤之首。在我国子宫内膜癌随着社会发展和生活水平的提高,发病率也有上升的趋势。现排在女性生殖系统恶性肿瘤第二位,仅次于宫颈癌。

KLK7蛋白是一种丝氨酸蛋白,是组织激肽释放酶(KLK)基因家族的新成员,最早被在人足底皮肤的角化层中分离提纯[4]。KLK7蛋白主要是在角质层上皮细胞表达。目前发现它广泛分布在人体组织和器官中,参与皮肤脱屑的过程[5]。对肿瘤的发生、发展、浸润和转移起着重要的作用。肿瘤细胞表层的 KLK7蛋白可能对肿瘤细胞的脱落及转移有影响。相关研究表明[6],KLK7基因在胰腺癌组织中表达显著加强,该基因的表达与胰腺癌的预后有关。通过本实验发现,KLK7基因在子宫内膜癌中的阳性率表达明显高于子宫内膜不典型性增生和正常子宫内膜。KLK7基因在子宫内膜上升趋势的高表达表示该基因可能导致肿瘤细胞发生、发展、浸润和转移的一个重要潜在因素。加上 KLK7在皮肤中就具有促进角质层细胞脱落的作用,综上,我们推测出 KLK7基因在子宫内膜癌中的作用很有可能与丝氨酸蛋白酶参与细胞间质的溶解和肿瘤细胞早期脱落有关,而且与促进癌细胞进一步浸润和转移。由此可见,对 KLK7蛋白广泛深入的研究,可了解肿瘤细胞浸润和扩散的具体机制,为肿瘤的临床治疗提供理论依据。

E-cadherin是一种分子量为120KD的钙依赖性黏附蛋白分子,主要在上皮细胞中分布,在细胞的形态发生和维持上皮的完整性以及同型细胞间的黏附、肿瘤细胞间保持密切接触等方面有着重要影响。E-cad蛋白正常情况下均在细胞边缘区成阳性表达,但在肿瘤组织中一般为低表达或是阴性表达。其低表达或是缺失可导致同型细胞或肿瘤细胞间的结构和功能异常,使介导细胞的黏附功能降低或丧失,而无限制增生导致使肿瘤浸润和扩散转移[7,8]。本实验表明,E-cad蛋白在子宫内膜癌、子宫内膜不典型性增生和正常子宫内膜组织中的表达明显下降,说明 E-cad蛋白的表达与肿瘤的发生有着密切的相关性。与相关研究结果相符合。进而可推测 E-cad蛋白低表达时可使细胞间黏附功能降低且肿瘤细胞间丧失接触性抑制,肿瘤细胞更容易分离、增生、脱落,扩散。

本研究显示,KLK7蛋白与E-cad蛋白在子宫内膜癌的阳性表达呈明显的负相关性,由实验结果可推断,KLK7蛋白与 E-cad蛋白在子宫内膜癌的发生、发展、转移及浸润中有着密切的关系。E-cad蛋白在正常子宫内膜中的高表达说明其维持着子宫内膜上皮的完整性,当 E-cad的阳性率降低时可能引起肿瘤细胞有离散的趋势,容易与原发灶脱落,出现浸润临近的组织,发生转移。与相关研究结果相符合。进而可推测 E-cad蛋白低表达时可使细胞间黏附功能降低且肿瘤细胞间丧失接触性抑制,肿瘤细胞更容易分离、增生增值、脱落,扩散。因此,E-cad的缺失表达提示着 E-cad蛋白参与者肿瘤细胞的发生与发展,当 E-cad蛋白缺失时,肿瘤细胞将具有更高的侵袭力和不良的预后。研究发现,KLK7蛋白可以通过裂解 E-钙黏蛋白而增强癌细胞侵袭细胞外基质的能力,阻断其连接,减少聚合能力。说明 KLK7蛋白和 E-cad蛋白在癌细胞的浸润和转移中起着重要的作用。

总之,肿瘤侵袭转移是非常复杂的生物学行为,许多转移基因和转移抑制基因都和此过程密切相关。通过本实验研究分析,在子宫内膜癌中,KLK7蛋白和 E-cad蛋白的表达呈负相关性,两者协同参与肿瘤的发生、发展、浸润和转移等过程。综上所述,KLK7蛋白和 E-cad蛋白在子宫内膜癌的发生、发展、浸润和转移中发挥重要的作用,对监测子宫内膜癌患者的病情及预后有着重要的意义。但两者确切的生理功能、蛋白作用机制和基因调控机制,相互作用机制尚未完全清楚,尚待进一步研究。

[1]乐杰.妇产科学 [M].第6版.北京:人民卫生出版社 ,2004,298-303

[2]罗宇,史林,赵时梅.E-cadherin在 I型子宫内膜癌中的表达 [J].华夏医学,2012,25(3):295-297

[3]佟丽波,杨秀莲,张丹凤,等.KLK7蛋白及 E-钙黏蛋白在卵巢癌中的表达及意义 [J].黑龙江医药科学,2011,33(6):3-5

[4]Caubet C,Jonca N,Brattsand,et al.Deg radation of corneodesmosome proteins bytwo serine proteases of the kallikrein family,SCTE/KLK5/hK5 and SCCE/KLK7/hK7[J].J Inv est Dermatol,2004,122(5):1235-1244

[5]Yamasaki K.Schauber Kallikrein-mediated proteolysis regulatesthe antimicrobial effects of cathelicidins in skin[J].Faseb J,2006,20:291-294

[6]Bajen M T,More S,M unoz A,et al.Effect of a diagnostic does of 185 MBq 131I on postsucgical thyroid remnats[J].J Nucl M ed,2000,41:109-114

[7]Vleminckx K,Mareel M.Geneticmanipulation of E-cadherin expression by epithelial tumor cells invasion suppressor role[J].1991,66(12):107-109

[8]Auersperg N,Grove BD,Pan J,et al.E-cadherin induces mesenchymal-to- epithelial in human ovarian epithelium[J].Proc Natl Acad Sei USA,1996,96(11):237-239