朱建华,崔丹丹,申文滨,刘继光

(1.佳木斯大学附属第二医院,黑龙江佳木斯 154002;2.佳木斯大学研究生处,黑龙江佳木斯 154007)

牙周炎(Periodontitis)是牙周支持组织的慢性感染性疾病,由最初牙周软组织的炎性改变,发展为结缔组织损伤及骨质破坏,是造成我国成年人失牙的主要原因。近年来的研究发现牙周炎不仅累及牙周组织,而且同样是导致一些全身性疾病发病的危险因素,严重影响人们的健康。糖尿病作为继肿瘤、心血管疾病之后的世界第三大非传染性疾病,同样威胁着人类的健康。已有学者提出牙周炎是糖尿病的第六并发症。目前,许多研究已经证实了糖尿病与牙周炎的双向关系[1]。糖尿病患者牙周病发病率明显高于无糖尿病者,并且病变损坏严重、进展迅速。因此,糖尿病牙周炎的治疗至关重要。

对于糖尿病牙周炎的患者的治疗目前还没有一种安全有效的有针对性的治疗方法,单纯治疗牙周炎的方法是不可行的,因为应用抗生素治疗对于糖尿病病人来说副作用太大许多病人都无法耐受,且抗生素的不合理应用影响降糖药物的有效吸收致使糖尿病患者血糖控制不良,由此导致牙周炎与糖尿病互为影响因素,病情进一步恶化。所以寻找一种安全有效的方法解除糖尿病病人患牙周炎的痛苦成为一种函待解决的问题。大量临床实践证明:中医中药治疗疗效确切,毒副作用少 ,费用低,且易于被患者接受。因此,寻找一种中药治疗糖尿病牙周炎就具有了十分重要的意义。

葛根素90年代开始应用于糖尿病及其并发症的研究,并取得了一定的成果[2]。大量的实验证明:葛根素可有效的控制血糖浓度,又可阻止蛋白质糖基化的过程,减少血清 AGEs的形成,下调其配体 RAGE的过度表达[3],且葛根素具有类雌激素样作用,可改善骨质代谢。近年来有学者研究表明100 μg˙L-1的葛根素在作用48 h后可以显著刺激成骨细胞ALP的合成分泌[4]。另一方面,葛根素又引起了体外破骨细胞形态学上的显著变化及骨吸收功能的下降。基于此基础,本研究通过动物实验,观察中药葛根素对糖尿病大鼠牙周炎的疗效,并初步探讨其机制,而为临床治疗糖尿病牙周炎提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

6～8周龄健康雄性 SD大鼠50只,体重180～220g(佳木斯大学实验动物中心提供 )。

主要试剂及药物:葛根素注射液 (安徽联谊药业股份有限公司生产,批号 120205);氨基弧盐酸盐 (美国 Sigma公司);四氧嘧啶 (alloxan)(中科瑞泰公司);Commassie改良增强型蛋白质定量试剂盒 (武汉博士德生物工程公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立及用药方法

将50只健康雄性 SD大鼠随机分为健康对照组(D组)10只、模型组40只,按200mg/kg剂量腹腔一次性注射10%四氧嘧啶诱导糖尿病 ,3d后,选择空腹血糖≥16.7 mmol/L的大鼠作为糖尿病模型。1周后,采用0.2mm正畸结扎丝加丝线,结扎糖尿病大鼠双侧上颌第一磨牙牙颈部,术后高糖饮食。4周后,随机抽取3只大鼠进行组织学观察,确认牙周炎模型建立。最后成模 30只 ,将成模大鼠随机分为 A实验组 (10只 ),B阳性对照组 (10只),C空白对照组 (10只 )。A组按100mg/kg˙d腹腔注射葛根素注射液,B组按 100mg/kg˙d经口灌注氨基胍水溶液,C组于腹腔注射等量的生理盐水。

1.2.2 血糖的检测

分别于成模后,用药第 4,6周上午 9时,测量大鼠空腹血糖。于大鼠尾静脉取血,采用拜安捷快速血糖仪(美国强生公司)测定血糖值。

1.2.3 标本制备

连续喂养6周,分别于4、6周时将大鼠各处死5只后 ,迅速剪取包括上颌骨、牙槽骨、牙及牙周组织在内的完整组织块,去除结扎丝,4%多聚甲醛固定24h,修整标本,仅保留磨牙区段颌骨及牙周组织,颊舌向拍摄三维 CT片,采集标本数码照片,并用其系统自带图像测量软件测量第一磨牙牙槽嵴顶高度的降低,即釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离,观察牙槽骨的吸收情况。然后将标本用15%的 EDT A4℃脱钙8周,每三天换一次脱钙液。脱钙完成后,脱水,包埋,制作上颌第一磨牙近远中向石蜡切片 ,片厚5μm,连续切片。 HE染色,选择切到完整的牙冠根组织的切片,观察牙周组织的改变。

大鼠心脏采血后,制备血清 。取0.2mL血清蒸馏水稀释至 2mL,参照文献[5]方法用荧光分光光度计(激发波长 /发射波长分别为354nm/462nm缝宽 10nm)测定血清 AGEs荧光强度。考马斯亮蓝法测定待测样品蛋白质浓度。样品中 AGEs的含量以 AU/mg˙蛋白 (AU/mg˙prot)表示。

1.3 统计学处理

用SPSS17.0统计软件进行,实验数据以均数±标准差(±s)表示,数据间差异性比较采用单因素方差分析,P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 大鼠一般情况,空腹血糖及口腔内情况

四氧嘧啶注射 24h后,大鼠即出现多饮,多食,多尿等症状。72h后,测得血糖高于16.7mmol/L,C组保持此值至实验结束。A、B组至实验结束时,有所好转。且血糖低于16.7mmol/L与 C组差异具有统计学意义 (P＜0.05),见表1。口腔内情况,D组大鼠牙龈组织呈粉红色,无充血 水肿,无松动等。A、B、C组大鼠在造模四周时,均出现了牙龈红肿,探诊出血,牙齿松动。在用药 4周时,A B组大鼠牙龈红肿程度及探诊出血量较 C组比较明显减轻。

表1 各组实验动物空腹血糖比较 (±s,mmol/L)

表1 各组实验动物空腹血糖比较 (±s,mmol/L)

注:*#与同一时期对照组比较,P＜0.05。

组别 用药前 用药后4周 用药后6周A组 24.29± 3.35* 16.28± 5.65* 12.03± 3.96*B组 21.73± 3.60# 14.15± 3.94# 12.53± 3.93#C组 22.91± 2.70 26.13± 3.12 27.02± 2.40 D组 5.08± 0.23 5.44± 0.47 5.68± 0.46

2.2 大鼠血清 AGEs含量的变化

大鼠血清 AGEs浓度变化在用药4,6周时 ,A组与 C组,B组与 C组比较差别均有统计学意义 (P＜0.05),A、B、C组与 D组比较差别均有统计学意义 (P＜0.05),但是6周时,A组与 B组比较无明显差异 (P＞ 0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清 AGES含量的比较 (±s,AU/mg.pro)

表2 各组大鼠血清 AGES含量的比较 (±s,AU/mg.pro)

注:*#与同一时期对照组比较,P＜0.05。

组别 用药后4周 用药后6周A组 83.46± 7.13* 74.33± 9.75*B组 71.00± 8.29# 66.72± 6.34#C组 114.50± 4.70 136.23± 5.47 D组 38.37± 4.02 41.03± 3.34

2.3 大鼠牙槽吸收状况

当用药4周时,各组大鼠牙槽骨吸收状况见表3。分别在根分叉及远中牙槽嵴顶处吸收较明显。其牙槽嵴高度的变化值 A组,B组明显低于 C组差异有统计学意义 (P＜0.05),但是仍明显高于 D组差异有统计学意义 (P＜0.05)。

表3 4周时,各组大鼠牙槽骨高度降低的比较 (±s,mm)

表3 4周时,各组大鼠牙槽骨高度降低的比较 (±s,mm)

组别 用药后4周A组 1.21± 0.21 B组 1.05± 0.13 C组 1.52± 0.27 D组 0.28± 0.04

2.4 组织学观察

光镜下可见,在给药四周时,健康组牙龈上皮以及牙周膜连续完整无破坏,无炎性渗出。结合上皮位置正常,牙龈胶原纤维无变性,无牙槽骨吸收。糖尿病牙周炎组,牙龈上皮糜烂坏死,呈现不连续的絮状物,牙周膜厚薄不一,牙周胶原纤维变性,结合上皮向根方增殖,形成深牙周袋,且上皮钉突伸长,牙槽骨高度降低,见大量的骨吸收陷窝。葛根素治疗组,牙龈上皮较完整炎症减轻,牙周膜连续,牙周胶原纤维增生,牙槽嵴顶见大量的新生骨基质及成骨细胞。

3 讨论

本实验选用传统的正畸结扎丝加缠丝线的方法结扎实验牙牙颈部 ,此方法丝线不容易脱落,有利于软垢、菌斑的附着,进而造成对牙龈的机械损伤,导致组织结构不完整 ,使牙龈易受细菌侵入,保证了牙周炎模型的可靠、稳定[6]。四氧嘧啶腹腔注射是最常用的,安全可靠的糖尿病造模方法。四氧嘧啶是一种β细胞毒剂,可选择性地损伤动物的胰岛素β细胞,使β细胞制造胰岛素的功能发生障碍而导致血糖过高和糖尿病[7]。

糖尿病患者牙周病发病率及病变程度高于非糖尿病人群。在糖尿病患者中,慢性高血糖可加速糖基化终产物(advanced glycation endroducts,AGEs)的 生成 ,导 致 AGEs在患者血浆及组织中累积。大量的实验证明:在 DM患者的牙周组织中 AGEs量和 RAGE表达皆升高。对外周血清中 C-反应蛋白、HbA1c、AGEs等生化指标与Ⅱ型 DM患者慢性牙周炎活动性(附着丧失程度)关联做了相关研究。结果显示AGEs水平与牙周炎的活动性密切相关。且曹晓丽[8]等也发现:糖尿病牙周炎大鼠血清中 AGEs增高是加重糖尿病牙周炎的一种因子。因此学者们认为 AGEs水平可作为评价 DM患者牙周炎是否加重的有效指标之一。

AGEs的致病途径可能主要是依靠与其细胞表面的受体RAGE相互作用,并激活一些列的细胞信号转导途径,影响一些细胞因子的表达 ,如 IL-1,IL-6等 ,且两者的结合同样会使巨噬细胞表型发生改变,释放更多炎性介质,这些炎性介质会激活破骨细胞和基质金属蛋白酶(matrix metallopro-teinases,MMPs)导致牙槽骨吸收和牙周结缔组织破坏。此外 AGEs的交联能激活一些胶原酶的活性,造成牙周组织的胶原成分大量降解,促进牙周附着丧失,这种高度交联的胶原累积还会使毛细血管基底膜增厚,导致牙周组织血供降低,影响其愈合能力,促进糖尿病牙周炎的发展。在 DM患者中,AGEs激活了多种致病途径 ,多种致病途径同样也促进了AGEs的形成。这样恶性的循环,导致糖尿病牙周炎的加重。因此控制血清中 AGEs的含量,是治疗糖尿病牙周炎的重要措施之一。本实验中,我们可以看到:A、B组用药4周与 6周比较,血清 AGEs的含量降低 ,同时大鼠牙龈探诊出血减轻 ,牙槽骨吸收减低。且 A、B组与 C组对比,随着 AGEs的含量的增加,大鼠牙周的炎症增强。

氨基胍是 AGEs干预药物中最经典的药物。它可抑制AGEs的合成和交联,目前已用于治疗 DM的并发症。且马淑媛等人通过动物实验已证实 AG对牙周炎有一定的抑制作用[9]。本实验中观察到用药 4,6周时 B组大鼠血清 AGEs的含量明显低于同期糖尿病牙周炎组,差异明显,具有统计学意义。而且与 C组比较大鼠的牙周炎症减轻,牙周胶原纤维增生,牙槽骨吸收减少,可见大量新生的骨基质。然而与 A组相比,在用药4周时,A组血清 AGEs的含量的要高于 B组,具有差异。但是 ,在用药6周时,两组的 AGEs的含量比较,无明显差异。可见中药葛根素对血清 AGEs的生成的抑制作用与氨基胍的作用相当。在组织病理片上,我们可以看到 A、B组大鼠的牙龈上皮较连续,牙周胶原纤维增生,且可见大量的新生骨基质。而且 A、B组牙槽骨高度降低的数值比较无明显差异,可见两者均在一定程度上抑制了大鼠牙周炎的发展。

中药葛根素具有改善心脑血管循环、降低心肌耗氧量,降低血糖,治疗糖尿病并发症等多种药理作用[2]。祖国医学中,许多中药具有调节内分泌功能,改善体内环境,防止骨吸收的作用。本实验结果显示:应用葛根素6周后 大鼠血清AGEs的含量,牙龈的炎症,以及牙槽骨的吸收程度均小于糖尿病牙周炎组,具有明显差异。与 B组氨基胍用药组相比,其抑制牙周炎的程度相当,无明显差异。其可能的机制:①葛根素可降低血糖,减少体内 AGEs的含量[10],进而阻止非酶糖基化的作用,改善牙周状况。②类雌激素样的作用。减少骨吸收、促进骨形成的作用。

根据本试验结果显示,中药葛根素注射液可通过减低大鼠血清 AGEs的含量,控制血糖,进而抑制大鼠糖尿病牙周炎的发展,其作用相当于西药氨基胍。

[1]孟焕新.牙周炎与糖尿病的关系 [J].北京大学学报,2007,39(1):18-20

[2]赵莹莲.葛根素的药理作用及临床应用进展 [J].安徽医药,2010,14(12):19

[3]茅彩萍,顾振纶.葛根素对糖尿病大鼠主动脉糖基化终产物的形成及其受体表达的影响 [J].中国药理学通报,2004,20(4):393-397

[4]李斌斌,于世凤.葛根素调控骨代谢的体外实验研究 [J].北京大学学报,2003,35(1):24

[5]蒋建平,侯凡凡.循环晚期糖基化终产物的检测方法和评价 [J].中华肾脏病杂志,2000,16(2):132

[6]曹晓丽,殷恺,张云,等.糖尿病牙周炎模型的建立 [J].天津医科大学学报,2010,16(3):7

[7]何学令,尹海林.四氧嘧啶剂量和给药途径对制作大鼠糖尿病模型的影响 [J].四川动物,2003,22(4):43

[8]曹晓丽,张云,李玉民,等.糖尿病大鼠并发牙周炎血清 AGEs浓度变化的研究 [J].天津医药,2010,38(6):29

[9]马淑媛,黄世光,王华东.氨基胍对牙周炎抑制作用的研究 [J].中国病理生理杂志,2002,18(12):1518-1520

[10]陈安凤,曹文富,焦颖华.解聚复肾宁对糖尿病大鼠血清 AGEs和肾 RAGE表达的影响 [J].重庆医科大学学报,2008,33(8):52