李春平，李 睿，郭丹丹

(川北医学院附属医院放射科，四川南充 637000)

肺癌骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种约为32.5 kDa蛋白链，多达28个磷酸化位点及一个蛋白裂的多功能蛋白，OPN可与CD44v6和整联蛋白结合介导一些信号转通道来控制细胞骨架重塑、细胞存活、增生和浸润等过程。Boldrinil等［1］不同方法研究中，OPN在不同肺癌中分布是不一致的。Schneider等［2］认为增高的OPN表达是一期非小细胞癌患者生存率预后不良的主要原因。肺癌患者癌组织内OPN的含量与肿瘤的影像学分期有无关系未见文献报道。为了能更好的确定不同类型周围型肺癌的OPN值的表达是否有差异以及肺癌患者癌组织内OPN与肿瘤的影像分期的关系，我们进行了相关的研究。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取我院2008年3月至2011年3月经皮CT穿刺活检并经病理确诊的肺癌组织标本143例，年龄32 ～76岁，平均年龄(56.53±10.95)岁，其中男性85例，女性58例。

1.2 研究方法

1.2.1 活检方法 采用TOSHIBA Xivision CT机，利用机架扫描光标在皮肤上标出穿刺点。测量穿刺点与病变的直线距离、进针深度和角度，使用巴德穿刺针穿刺，从不同方向切割组织1～2条，将标本固定送组织学检查，选其肺癌阳性的病例做免疫组化检查。

1.2.2 病理检查 病理标本为病灶中央取材，常规4%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片厚约4 μm。采用SP免疫组织化学检测OPN的表达。鼠抗人OPN单克隆抗体(迈新生物科技公司)，免疫组织化学染色试剂盒(迈新生物科技公司)。

1.2.3 抗原修复 采用柠檬酸盐缓冲液高温高压抗原修复法。石蜡切片脱蜡、水化后放入盛有柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)的容器中，高压加热1～2 min后，室温冷却。切片先用蒸馏水冲洗2次，过氧化酶阻滞剂50 mL 10 min，PBS冲洗。

1.2.4 免疫组化步骤 一抗(OPN 1∶50)(Santa-Cruz)4℃过夜，PBS冲洗3次;生物素化一抗加辣根过氧化物酶标记的亲和素(1∶50)，室温温育1 h，PBS冲洗3次;非生物素化一抗加兔Envinsion试剂(Dako)，室温温育30 min，PBS冲洗3次;DAB(华美生物工程公司)显色，显微镜下观察5～10 min，在显色最佳时用PBS冲洗，终止显色;苏木素复染细胞核，水洗，蓝化，脱水，中性树胶封片。

1.2.5 OPN阳性反应 采用双盲法观察，用低倍镜和高倍镜观察切片。判断标准:每张切片随机选取5个高倍视野，每个视野计数100个细胞观察阳性细胞染色强度，计数阳性细胞百分数。按着色细胞百分数计分:着色细胞＜10%为0分，10% ～40%为1分，40% ～70%为2分，≥70%为3分。按着色强度计分:无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分。将着色细胞百分数计分与着色强度计分相乘作为总计分。总计分为0分为阴性(-)，1～3分为弱阳性(+)，4分以上为强阳性(+﹢)。统计时以(-)判定为阴性，(+)和(++)判定为阳性。

1.3 统计学分析

所有统计学分析采用SPSS11.5软件进行。采用配对检验比较鳞癌与腺癌的OPN表达;利用方差分析比较分叶征、胸膜凹陷征、血管支气管集束、胸膜浸润等CT征像与OPN表达的阳性强度。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OPN的表达情况及其相关性

OPN在肺癌组织中有较强的阳性表达率。阳性染色主要位于细胞膜上，胞浆中亦有少量表达。阳性染色呈棕色。143例肺癌标本，其中鳞癌83例(图1)，腺癌60例(图2)。肺癌组织中OPN的表达与肿瘤的分化程度和临床分期相关(P＜0.05)，而与病理组织类型无关(P＞0.05)，见表1。

表1 肺癌OPN表达与临床病理的关系

2.2 OPN的高表达与年龄、性别、肿块大小的关系

143例患者中年龄小于50岁的30例，大于50岁的113例，年龄比较P=0.373(P＞0.05)，差异无统计学意义。男性85例，女性58例，性别比较P=0.923(P＞0.05)，差异无统计学意义。肿块小于3 cm者62例，肿块大于3 cm者81例，肿块大小比较P=0.468(P＞0.05)，差异无统计学意义。

2.3 OPN的高表达与CT特征性的关系

分叶征与无分叶征比较P=0.036(P＜0.05)，OPN有较强的阳性表达(图3、图4)。胸膜凹陷征与无胸膜凹陷征比较P=0.000(P＜0.05)，胸膜凹陷征病例，在肺癌组织免疫标本中，OPN有强阳性表达(图5、图6)。血管支气管集中征与无血管支气管集中征比较P=0.001(P＜0.05)。结果表明肺癌影像特征表现与OPN表达差异有统计学意义，结果见表2。

表2 OPN的表达与CT特征性的联系

2.4 OPN的表达与肺癌淋巴结转移的关系

143例肺癌患者中有淋巴结转移120例 (ⅡA:T1N1M012例;ⅡB:T2N1M013例，T3N0M021例，ⅢA:T3N1M014例，T1-3N2M020例;ⅢB:T4N0-2M05例，T1-4N3M05 例，Ⅳ:任何 T，任何 N，M130 例)，无转移23例，120例已发生淋巴结转移的肺癌组织中，OPN的阳性表达为(120/120)。OPN的表达与肺癌转移有明显一致性，见表3。

表3 肺癌OPN表达与肺癌淋巴结转移的关系

2.5 OPN的表达与肿瘤临床分期的关系

OPN的表达与肺癌转移有一致性，随着肺癌TNM分期的增加，P=0.000(P＜0.05)，差异有统计学意义。其中肺癌转移至头部9例，转移至肝脏7例，转移至肋骨6例，转移至胸腰椎1例，OPN的表达量明显增加，OPN的表达与肺癌TNM分期差异有统计学意义，见表4。

表4 OPN的表达与肿瘤临床分期的关系

3 讨论

肿瘤的影像学表现在本质上是由分子生物学因素所决定的宏观病理形态改变的具体体现［3-4］，所以通过特定CT征象的形态学改变可以在某种程度上反映肿瘤的生物学信息，如恶性程度、侵袭转移潜能等。研究发现，肺癌的影像学表现与分子生物学因素之间存在不同程度的联系［5-6］，分叶征是瘤体向各部位生长速度不同、以及与周围结构的制约等因素有关，深分叶征在肺癌中具有重要的诊断价值［7-8］。毛刺征是由于癌组织向邻近肺实质延伸和浸润的结果。本组试验显示具有深分叶征、毛刺征的肺癌OPN呈明显的高表达，其原因可能由于OPN高表达使肿瘤细胞之间的黏附力降低，并且释放蛋白酶降解细胞外基质，破坏基底膜从而使肿瘤细胞更易于向周围浸润性生长［9-10］。分叶征、毛刺征的肺癌有更高的侵袭转移潜力，恶性程度更高，预后更差。胸膜侵犯和纵隔淋巴结转移使肿瘤TNM分期增高，手术完全切除的难度增加，从而降低患者的生存率。本组试验显示肿瘤侵犯胸膜和纵隔淋巴结大时OPN表达明显增高，与肺癌的侵袭转移相关。本组实验还显示胸膜凹陷征、血管支气管集束征、胸膜浸润征的出现与OPN相关，表明此征与肺癌的恶性程度、侵袭转移能力关系显著(P＜0.05)。研究还显示OPN蛋白的异常表达与患者年龄、性别、肿瘤的大小无明显相关性(P＞0.05)，肺癌在CT影像TNM分期与骨桥蛋白成正相关。随着肺癌TNM分期的增加骨桥蛋白表达更明显，可能由于不同的生物学因素在肿瘤的不同阶段所起的作用不同，所以联合检测多种基因更有利于客观全面的评价肿瘤的恶性生物学行为，评估预后。通过研究骨桥蛋白与肺癌在CT影像分期的联系，经穿刺取得病理学依据的肺癌患者，对其CT影像征象进行分期，通过对肺癌组织内骨桥蛋白与CT肺癌TNM分期相关性研究，从微观与宏观角度为肺癌早期诊断和预后提供方案。OPN参与了肺癌的发生、发展和转移，TNM分期越高OPN表达越明显，OPN可作为临床TNM分期的主要生化指标，可作为判断肺癌患者的预后及术后复发的参考指标，为临床病人的治疗提供更好的依据。

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