郑亚萍，康红钰

(漯河医学高等专科学校，河南漯河 462002)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见且最严重的并发症之一，是糖尿病致残致死的重要原因。赤芍组成的方剂具有明显保肾疗效［1］，但单方赤芍对糖尿病肾病的作用及相关机制尚少见报道。本研究通过观察赤芍对DN肾功能的影响及肾组织相应肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、细胞间黏附因子-1(ICAM-1)和巨噬细胞ED-1表达变化，初步探讨赤芍对DN发生、发展的作用以及可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物

体质量200～250g的雌性SD大鼠，由郑州大学医学院实验动物中心提供。

1.2 试剂

链脲佐霉素(STZ，Sigma公司产品)，赤芍注射液(漯河医专分析测试中心)，小鼠抗大鼠ED-1(巨噬细胞表面标志)，单克隆抗体(美国 Santa Cruz公司)，链酶亲和素-生物素复合物、DAB试剂盒(武汉博士德)，RT-PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。

1.3 DN模型和分组

采用左肾摘除加高糖高脂饮食加小剂量STZ 30mg/kg腹腔注射制备糖尿病肾病模型，以注射72h后血糖高于16.7mmol/L，为 DN模型建立成功［2］。大鼠随机分为正常对照组(NC组)、糖尿病肾病组(DN组)、赤芍组腹腔注射30g/kg赤芍，正常对照组和糖尿病肾病组给予同剂量的生理盐水腹腔注射，每日1次，连续给药8周。

1.4 标本采集及处理

第8周末收集各组大鼠24h尿，离心后－20℃保存;动物麻醉称重，股动脉放血，离心后血清－80℃保存;取右肾去包膜后称重并于4%甲醛固定。

1.5 血尿素氮(BUN)、内生肌酐清除率(Ccr)及24h尿蛋白测定

用OLYMBUSAU-600全自动生化仪测测大鼠尿素氮、血肌酐，采用放免法测定24h尿微量蛋白含量。

1.6 RT-PCR 检测 TNF-α、MCP-1、ICAM-1 mRNA表达

按Trizol说明提取细胞 RNA，逆转录合成cDNA，为其以模板做PCR扩增。扩增片断引物TNF-α(203bp):5’-TTCTCATCCTGCTCGTGG-3’，5’-TTTGGTGGTTCGCCTCCT-3’;MCP-1(432bp):5’-GCCAGATCTCTCTTCCTCCA-3’;5’-GAGG TG GTTGTGGAAAAGAG-3’;ICAM-1:(413bp)5’-GG CG TCCATTTACACCTATTA-3’，5’-TTCCTTTTCTT CTCTTGCTTG-3’;内参基因 β-actin(141bp):5’-GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT-3’，5’-AGAT CCACATCTGCTGGAAGGT-3’。PCR产物在10g/L琼脂糖凝胶(EB染色)电泳检测，以 Marker为分子大小标记，以与内参β-actin的 PCR扩增产物条带光密度之比作为反映 TNF-α、MCP-1、ICAM-1 mRNA水平的相对指标。

1.7 SABC法检测肾脏ED-1阳性细胞数

切片常规脱蜡水化，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，微波封闭内源性生物素;滴加1∶10正常羊血清或兔血清;10%小牛血清蛋白封闭非特异性抗原。滴加小鼠抗大鼠ED-1单克隆抗体(1∶50)，4℃过夜。滴加生物素化二抗IgG(1∶200)，37℃ 20min滴加SABC，37℃ 20min。洗涤后室温下滴加DAB显色液，镜下控制显色时间。中止反应后，苏木素复染3 min，1%盐酸乙醇分化。常规脱水、透明、封片。实验采用删除第一抗体作阴性对照。阳性物质呈棕色颗粒状，高倍镜视野下随机选择30个肾小球，计数每个肾小球横截面积(gcs)ED-1阳性细胞数，取均值。

1.8 统计学处理

采用SPSS 10.0统计软件，计量资料用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般指标

表1显示，与对照组比较，DN组显著增加BUN、Ccr、24h尿微量蛋白及肾重/体质量(P＜ 0.01)，赤芍可显著抑制糖尿病肾病大鼠的BUN、Scr、24h尿微量蛋白及肾重/体质量增加。

表1 各组DN大鼠BUN、Scr、24h尿微量蛋白及肾重/体质量(±s)

表1 各组DN大鼠BUN、Scr、24h尿微量蛋白及肾重/体质量(±s)

注:与正常对照组比较:*P ＜0.05，＊＊P ＜ 0.01;与DN组比较:#P ＜ 0.05，##P ＜0.01

组 别 例数(只)BUN(mmol/L)Scr(μmol/L)24h尿微量蛋白(μg/24h)肾重/体质量/×10－3正常对照组10 6.49 ±0.68 39.4 ±3.2 14.35 ±2.53 2.9 ±0.6 DN 组 12 17.28 ±1.44＊＊ 58.9 ±6.4＊＊ 43.85 ±9.18＊＊ 6.8 ±0.7＊＊赤 芍 组 10 12.64 ±0.83*## 46.7 ±4.8*# 25.53 ±9.27*## 4.1 ±0.5*#

2.2 各组大鼠肾脏 TNF-α、MCP-1、ICAM-1 mRNA表达

表2各组大鼠肾脏TNF-α、MCP-1、ICAM-1mRNA表达(±s)

表2各组大鼠肾脏TNF-α、MCP-1、ICAM-1mRNA表达(±s)

注:与正常对照组比较:*P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01;与 DN组比较:#P ＜0.05，##P ＜ 0.01

组 别 例数(只) TNF-αMCP-1 ICAM-1正常对照组10 0.56 ±0.11 0.89 ±0.15 1.08 ±0.16 DN 组 12 2.09 ±0.32＊＊ 1.93 ±0.38＊＊ 2.33 ±0.15＊＊赤 芍 组 10 0.97 ±0.26*##1.25 ±0.19*## 1.35 ±0.13##

表2显示，与对照组比较，DN组 TNF-α、MCP-1、ICAM-1 mRNA表达显著增加(均P＜ 0.01)，而赤芍抑制糖尿病肾病大鼠的TNF-α、MCP-1、ICAM-1 mRNA表达(图1～3)。

图1 各组大鼠肾脏TNF-αmRNA表达

图2 各组大鼠肾脏MCP-1mRNA表达

图3 各组大鼠肾脏ICAM-1mRNA表达

2.3 各组大鼠肾脏ED-1阳性细胞数

表3显示，DN组肾小球可见呈现褐色颗粒ED-1阳性表达的巨噬细胞显著较对照组增多(P＜0.01)(图4)，赤芍组可减少肾小球内褐色颗粒ED-1阳性表达的巨噬细胞浸润及增殖显著增加(P＜0.01)。

图4 各组肾小球ED-1阳性表达(×400)

3 讨论

TNF-α是由激活的单核-巨噬细胞产生的小分子多肽，能发挥聚集巨噬细胞、刺激成纤维细胞增殖及胶原合成，在肾组织纤维化起重要作用。有研究显示，TNF-α 可通过上调 MCP-1及 ICAM 表达［2］，进而促使巨噬细胞迁移至受累组织。本研究显示，链脲佐霉素腹腔注射制备的大鼠DN模型TNF-αmRNA表达及巨噬细胞浸润、增殖较对照组显著增加。

表3各组大鼠肾脏ED-1表达(±s)

表3各组大鼠肾脏ED-1表达(±s)

注:与正常对照组比较:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与DN组比较:#P＜ 0.05，##P ＜ 0.01

组别 例数(只) 肾小球(n·gcs－1)正 常 对 照 组10 0.91 ±0.53 DN 组 12 3.75 ±1.09＊＊赤 芍 组 10 2.13 ±0.68*##

单核-巨噬细胞、肾小管细胞等可产生 MCP-1，MCP-1对单核巨噬细胞具有特异性趋化激活作用，且随后引发胶原 mRNA表达增加 ，这与肾小球纤维化密切相关［3，4］。敲除ICAM-1基因大鼠肾小球巨噬细胞浸润减少，Ⅳ胶原增生也下降［2，5］，证实MCP-1、ICAM-1在糖尿病肾脏病中发挥关键作用。本实验也证实，链脲佐霉素所致的DN肾小球就有ICAM-1及MCP-1 mRNA的表达增加。

单核-巨噬细胞在肾小球和肾间质浸润是DN的特征性表现，肾组织中浸润的巨噬细胞在激活后产生损伤介质，巨噬细胞局部增殖与肾脏病理损害及肾功能衰退密切相关，对DN的发生发展起重要作用［6，7］。本动物实验也发现，糖尿病大鼠肾小球有大量ED-1表达的巨噬细胞浸润，且其浸润程度显著高于对照组大鼠，聚集的巨噬细胞产生各种细胞因子如TNF-α、ICAM-1及 MCP-1，进一步加速了肾组织纤维化。

赤芍能下调血脂、抑制血小板聚集及血栓形成，临床研究已有其组方治疗糖尿病肾病。我们先前研究表明，其能降低血脂、减少BUN、Scr及24h尿微量蛋白，发挥保护肾脏的作用。本研究在此基础上进一步探讨赤芍对DN保护作用机制，结果显示赤芍能通过抑制 TNF-α来减少肾组织 ICAM-1及MCP-1表达，进而减少肾组织巨噬细胞浸润及增殖，发挥抗纤维化作用从而产生对肾脏的保护作用。

［1］王秀霞，郑亚萍，王玉中.益肾排浊汤配合贝那普利治疗糖尿病肾病的临床研究［J］.辽宁中医杂志，2009(6):56-58.

［2］秦贵军，岳欣阁，张贺，等.糖尿病大鼠肾小球IL-18、ICAM-1和TNF-α表达的实验研究［J］.中国糖尿病杂志，2008(9):541-543.

［3］Tam F W，Riser B L，Meeran K，et al.Urinary monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)and connective tissue growth factor(CCN2)as prognostic markers for progression of diabetic nephropathy［J］.Cytokine，2009，47(1):37-42.

［4］Malik A R，Little M A，Henriksson M，et al.Peritonitis，peritoneal inflammation and membrane permeability:a longitudinal study of dialysate and serum MCP-1 in stable patients on peritoneal dialysis［J］.J Nephrol，2007，20(3):340-349.

［5］王兴木.血清 sICAM-1、Ⅳ-C检测与DM2肾病相关性分析［J］.放射免疫学杂志，2007(1):47-48.

［6］Sheryanna A M，Smith J，Bhangal G，et al.Treatment with a cyclin-dependent kinase inhibitor， seliciclib， iseffective in reducing glomerular macrophage numbers and the severity of established experimentalglomerulonephritis［J］. Nephrology(Carlton)，2011，16(4):410-416.

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