芦北极 王贵清 刘春磊 (暨南大学附属清远医院骨科，广东 清远 511500)

髋关节骨性关节炎是一种高致残疾病，主要特征是关节功能减退并伴有疼痛〔1〕。骨关节炎的主要病理表现为软骨组织退变和磨损，软骨损伤后很难修复〔2〕，因此加快软骨组织修复对治疗髋关节骨性关节炎意义重大。Ⅱ型胶原是关节软骨基质胶原，由3条相同的Ⅱ型胶原α1链(Col2α1)组成，是软骨组织修复的基础〔3〕。关节炎是一种炎症因子介导的免疫反应〔4〕。激活T细胞核因子1(NFAT1)是一种与炎症相关的基因，可在T细胞及其他免疫细胞中表达〔5〕，因此推测其水平与关节炎的发生发展有关。目前，对髋关节骨性关节炎软骨组织中Col2α1和NFAT1的研究较少。因此本研究分析髋关节骨性关节炎的Col2α1和NFAT1表达水平及临床意义，为防治髋关节骨性关节炎提供依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料 本院2011年6月至2012年6月骨科收治的36例髋关节骨性关节炎患者为关节炎组，其中男性21例，女性15例;年龄43～77岁，平均(65.1±7.5)岁，＞60岁者11例;左侧17例，右侧19例;原发性4例，继发性32例;病程为(2.3±0.9)年，＞2年者 14例;关节炎严重性指数评分(ISOA)≤4者16例，＞4者20例;K-L放射线分级:Ⅰ+Ⅱ级者14例;Ⅲ+Ⅳ级者22例;轻度10例，中度15例，中度11例。并选取同期的40例股骨颈骨折患者为骨折组，其中男性23例，女性17例;年龄41～75岁，平均(64.8±10.2)岁，＞60岁者16例;左侧25例，右侧15例;骨折部位:头下型31例，颈中型7例，合并股骨头骨折2例。排除类风湿关节炎、肿瘤骨转移及股骨头坏死者。

1.2 组织标本收集 软骨组织标本用于mRNA抽提和蛋白提取两部分，均在本院的伦理委员会监督下进行组织标本收集，具体步骤:取全髋关节置换后的手术废弃物，用刀片轻轻刮除髋关节表层软骨，取髋关节股骨头负重区域的深层软骨。

1.3 试剂 RNAlater保存液，美国 Sigma公司;Rneasy Fibrous Tissue Mini kit，德国Qiagen公司;逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒，大连宝生物工程有限公司;Col2α1、NFAT1鼠抗人单克隆抗体，美国Santa Cruz公司;GADPH、辣根过氧化物酶(HRP)标记鼠二抗、兔二抗单克隆抗体，武汉博士德生物技术公司;其他试剂均为分析纯。Col2A1和NFAT1引物均由Invitrogen公司合成。

1.4 RT-PCR法检测mRNA水平 称取软骨标本1.2 g，提取总RNA，采用分光光度计检测RNA浓度与纯度。配制 RT反应液(反应在冰上进行)，在如下条件进行反转录37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 4 h，将cDNA贮存于－20℃冰箱中备用。对cDNA模板进行优化，配置PCR反应液，两步法PCR扩增目的基因。预变性:95℃ 30 s;PCR反应:95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。结束后确认扩增和溶解曲线，以GAPDH为内参，采用ΔΔCt法分析实时定量扩增的效果。Col2α1上游:5'-GGTGTCAGGGCCAGGATGT-3';下游:5'-ACAATATCCTTGATGTCTCCAGGTT-3'。NFAT1上游:5'-AGCAGGGCGAGAGGAGAAAC-3';下游:5'-AGTCACTGGGATGCTGCAGAT-3'。GAPDH上游:5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3';下游:5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。

1.5 Western印迹法检蛋白水平 以1∶10(重量/体积)加蛋白裂解液，冰上匀浆处理，静置1 h，高速离心(12 000 r/min×5 min)，取适量上清液与等体积2×上样缓冲液混合后，65℃孵育10 min后，经过SDS-PAGE电泳后，转至 PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后，以一抗为1∶500的抗 Col2α1，NFAT1一抗抗体进行杂交，室温，1 h，以TBST充分洗膜3×5 min后，加入二抗(1∶5 000)进行杂交，室温1 h，以 TBST充分洗膜3×5 min后，采用 ECL法曝光，内参为 GAPDH，并运用 Quantity-One软件进行光密度分析。最终结果表示为与GAPDH条带光密度的比值。

2 结果

2.1 两组 Col2α1和 NFAT1的表达水平比较 关节炎组Col2α1和 NFAT1的 mRNA和蛋白水平均高于骨折组，除NFAT1的mRNA水平(P＜0.05)，其余均为P＜0.01，见表1和图 1、图 2。

表1 两组Col2α1和NFAT1的表达水平()

表1 两组Col2α1和NFAT1的表达水平()

与骨折组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

组别 n mRNA水平(2－△△Ct)Col2α1 NFAT1蛋白水平Col2α1 NFAT1骨折组40 1.06±0.23 1.57±0.15 0.32±0.05 0.28±0.09关节炎组 36 1.65±0.412) 2.46±0.341) 0.67±0.112) 0.53±0.142)

图1 两组关节软骨中NFAT1和Col2α1表达水平

图2 两组关节软骨中NFAT1和Col2α1蛋白水平的Western原始记录图

2.2 髋关节骨性关节炎不同病理参数的mRNA水平情况Col2α1和NFAT1的mRNA水平在年龄、类型、病程、ISOA、K-L放射线分级及严重程度上有差异，除Col2α1的K-L放射线分级(P＜0.05)，其余均为P＜0.01;两指标mRNA水平在性别和侧别上无统计学差异。见表2。

2.3 髋关节骨性关节炎不同病理参数的蛋白水平情况Col2α1和NFAT1的蛋白水平在年龄、类型、病程、ISOA、K-L放射线分级及严重程度上有差异，除Col2α1的类型(P＜0.05)，其余均为P＜0.01;两指标mRNA水平在性别和侧别上无统计学差异。见表2。

表2 髋关节骨性关节炎患者不同病理参数Col2α1和NFAT1的mRNA和蛋白水平()

表2 髋关节骨性关节炎患者不同病理参数Col2α1和NFAT1的mRNA和蛋白水平()

与对应项比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

年龄(岁)≤60 1.27±0.32 1.86±0.24 0.34±0.12 0.31±0.09＞60 1.82±0.572)2.74±0.612)0.86±0.372)0.78±0.252)侧别左侧 1.57±0.43 2.36±0.31 0.59±0.14 0.47±0.11右侧 1.68±0.46 2.52±0.39 0.72±0.17 0.58±0.15类型原发性 1.14±0.25 1.93±0.33 0.46±0.26 0.28±0.07继发性 1.91±0.612)2.66±0.542)0.83±0.141)0.82±0.222)病程(年)≤2 1.33±0.35 2.07±0.42 0.44±0.15 0.31±0.12＞2 1.87±0.732)2.73±0.632)0.91±0.322)0.77±0.242)性别男 1.58±0.46 2.53±0.47 0.61±0.15 0.58±0.15女 1.69±0.52 2.38±0.35 0.74±0.09 0.51±0.17 ISOA≤4 1.36±0.36 2.13±0.36 0.35±0.12 0.33±0.10＞4 1.88±0.752)2.80±0.722)0.78±0.252)0.81±0.282)K-L放射线分级Ⅰ+Ⅱ 1.45±0.26 1.93±0.26 0.27±0.08 0.36±0.12Ⅲ+Ⅳ 1.73±0.431)2.85±0.882)0.93±0.262)0.85±0.252)严重程度轻度 1.15±0.28 2.24±0.34 0.34±0.12 0.29±0.14中度+重度 1.82±0.682)2.86±0.552)0.85±0.252)0.83±0.232)

3 讨论

Col2α1与关节软骨形成及关节内成骨密切相关。异常机械应力和滑膜炎症可影响软骨基质的代谢平衡，导致关节软骨表面的Ⅱ型胶原水平降低，同时机体会代偿性的增加深面Ⅱ型胶原水平〔6〕。本研究提示关节炎患者软骨组织中的Col2α1水平上调，可能原因是关节炎患者的炎症反应导致软骨组织代偿性地增加Col2α1水平，来促进软骨组织的修复。这与Pickarski等〔7〕在前交叉韧带切断和半月板切除诱导的骨性关节炎模型中的发现一致，同时还发现损伤部位关节软骨和软骨下骨中的血管浸润标记物VEGF和CD31水平的上调。此外，也有相关报道指出Col2α1可改变软骨细胞表型，进而导致软骨矿物质成分改变和钙化增厚，使关节炎症状恶化〔8〕。张雪莲等〔9〕认为Col2α1的异常表达引起Ⅱ型胶原结构异常，可导致骨骼-软骨发育异常疾病。

此外，本研究提示软骨组织中的NFAT1水平上调，表明关节炎患者软骨组织中的炎症反应被激活，是导致关节软骨损伤的直接原因。本研究的特色之一是分析不同病理参数的两指标水平，发现均与病理参数相关，如在年龄、类型、病程、ISOA、K-L放射线分级及严重程度上有差异，且病情严重者的水平较高，提示可用于疾病的诊断和预后预测，如崔英霞等〔10〕将Col2α1基因突变情况用于先天性脊柱骨骺发育不良的产前诊断，具有一定的临床价值。

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3 钱晓伟，潘丹岷，谭湘陵，等.中药血清对大鼠bMSCs体外成软骨分化中Col2α1和Acan表达的影响〔J〕.时珍国医国药，2012;23(2):340-3.

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6 Fan B，Onteru SK，Mote BE，et al.Large-scale association study for structural soundness and leg locomotion traits in the pig〔J〕.Genet Sel Evol，2009;41:14.

7 Pickarski M，Hayami T，Zhuo Y，et al.Molecular changes in articular cartilage and subchondral bone in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis〔J〕.BMC Musculoskelet Disord，2011;12:197.

8 崔英霞，夏欣一，杨 滨，等.COL2A1基因突变致先天性脊柱骨骺发育不良的软骨组织超微结构观察〔J〕.医学研究生学报，2009;22(4):376-9.

9 张雪莲，曲建平，任立红，等.COL2A1基因突变致骨骼-软骨发育疾病研究进展〔J〕.国际遗传学杂志，2012;35(2):119-24.

10 崔英霞，夏欣一，冯 耀，等.COL2A1基因突变所致先天性脊柱骨骺发育不良的产前分子诊断〔J〕.临床检验杂志，2007;25(4):254-6.