范晓艳 吕冬霞 姚海涛 金岳雷 (佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

随着细胞凋亡研究的不断深入，诱导细胞凋亡的药物也不断被发现，同时药物诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究更成为研究的热点。五味子乙素(schisandrin B，SchB)系木兰科植物五味子的干燥成熟果实的提取物，刘力生等〔1〕研究显示SchB对小鼠免疫功能、腹水型肝癌细胞DNA合成具有抑制作用。顺铂是一种类烷化剂的金属铂类化合物，为常用的化疗药物。本实验将SchB与顺铂联合作用于H22小鼠实体瘤，观察两者联合作用后p53的表达变化。

1 材料与方法

1.1 材料 SohB成都巨邦生物工程有限公司惠赠;顺铂:中国山东省德州制药厂，批号20070516;实验瘤源小鼠:H22腹水瘤小鼠购于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院动物中心;实验动物:昆明种近交系小鼠，体重(20±2.0)g，雄性，佳木斯大学实验动物中心提供，许可证号:黑动字第99101001，普通级，普通环境饲养。p53免疫组化试剂盒:武汉博士德生物公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与用药 将接种H22瘤种8 d的腹水瘤小鼠以脱颈法处死，无菌条件下抽取腹水瘤细胞悬液5 ml，经离心稀释，用生理盐水重新悬浮细胞，细胞悬液浓度为1×1010/L。以0.2 ml/只接种于被试的40只昆明种小鼠右腋下，制成实体瘤动物模型。于接种24 h后，将40只被试小鼠随机分成4组:单纯顺铂组、单纯SchB组、SchB联合顺铂组(以下简称联合组)和对照组。顺铂用生理盐水溶解后按2.5 mg/kg腹腔注射，SchB用生理盐水溶解后按200 mg/kg灌胃。腹腔注射剂量为0.2 ml，灌胃剂量为0.4 ml，连续处理7 d。单纯顺铂组:早上腹腔注射顺铂，晚上生理盐水灌胃;单纯SchB组:早上生理盐水腹腔注射，晚上SchB灌胃;SchB联合顺铂组(以下简称联合组):早上腹腔注射顺铂，晚上SchB灌胃。对照组:早上生理盐水腹腔注射，晚上生理盐水灌胃。

1.2.2 苏木素-伊红(HE)染色观察凋亡细胞形态 接种后第9天处死小鼠，剖出完整的肿瘤组织，用4%的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm切片，用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，最后进行常规HE染色，在显微成像系统下观察结果。

1.2.3 p53表达检测 分离出实体瘤组织，肉眼下切取无坏死1 mm3肿瘤组织2块，用10%甲醛固定后进行常规石蜡包埋。免疫组化用常规亲和素-生物素-过氧化酶复合体(SABC)法，具体操作按说明书进行。统计学处理:分别观察制片后的p53表达，细胞膜和细胞质出现棕黄色或褐色为半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)表达阳性细胞，胞浆和胞核内出现棕黄色或褐色为p53阳性表达细胞。显微镜下选取每个区域不重复随机10个高倍视野(×400)，计算p53阳性细胞数，求均值。

1.3 统计学方法 应 用SPSS10.0统计软件进行分析，数据资料以表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 联合用药对小鼠H22实体瘤细胞形态 镜下观察，与对照组比较，用药组出现肿瘤细胞减少，并大面积坏死;染色质固缩浓染，有的呈半月形，紧贴于核膜周边，部分细胞裂解为碎片状。细胞形态学改变见图1。

图1 联合用药组(HE，×400)

2.2 联合用药对p53表达的影响 实验结果表明，单纯顺铂组与单纯SchB组p53的阳性率与对照组比较差别有统计意义(P＜0.05)，且联合组与对照组比较差别有显著统计学意义(P＜0.01)。方差分析显示单纯顺铂组与单纯SchB组间p53差异无显著性，联合组抑瘤率明显高于单纯顺铂组及单纯SchB组(P＜0.05)。见表1。

表1 各抗肿瘤药物对H22小鼠实体瘤p53表达影响(%)

3 讨论

凋亡细胞〔2〕的形态学改变可分为三个阶段:①凋亡起始阶段的细胞形态学变化主要是有完整细胞膜，但特化结构消失，细胞间的接触消失，仍然有选择透性;染色质出现固缩，沿着核膜分布，形成新月形帽状结构等形态。②第二阶段形成凋亡小体。核染色质发生断裂，形成大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞膜所包围。从外观上看，细胞表面产生了许多泡状或芽状突起。以后，逐渐分离，形成单个的凋亡小体。③凋亡小体逐渐为临近的细胞所吞噬并消化〔3〕。本实验通过对肿瘤的HE染色，在显微镜下观察显示存在细胞凋亡，说明SchB五味子乙素可促进H22肿瘤细胞凋亡。

p53是一种抑癌基因，与多种基因之间构成p53基因网络，有促进细胞凋亡、阻滞细胞周期、维持基因组稳定等功能〔4〕。当细胞内DNA受损时，p53蛋白表达水平增高，导致细胞增殖终止，使受损的细胞获得修复DNA的时间，假如无法修复，那么p53蛋白将持续增高，从而引起细胞凋亡。本实验结果说明SchB联合顺铂抑制肿瘤生长与p53高表达有关。

顾颖等〔5〕研究表明SchB可促进多柔比星诱导肝癌细胞(SMMC-7721)凋亡，梁军等〔6〕研究 SchB对人胃癌细胞株(MGC-803)凋亡的影响。本实验表明了SchB联合顺铂可诱导肿瘤细胞凋亡，将进一步研究两者联合作用抑制肿瘤的机制，为SchB联合顺铂在临床应用提供更有力的依据。

1 刘力生，王 勤，郑荣梁，等.五味子乙素对小鼠免疫功能、腹水型肝癌细胞DNA合成和存活率的作用〔J〕.兰州大学学报(自然科学版)，1990;5(1):55-9.

2 吕冬霞.细胞生物学技术〔M〕.北京:科学出版社，2010:138.

3 翟中和，王喜忠，丁明孝.细胞生物学〔M〕.北京:高等教育出版社，2000:455-7.

4 Vogelstein B，Lane D，Levine AJ.Surfing the p53 network〔J〕.Nature，2000;408(6810):307-10.

5 顾 颖，李 凌.五味子乙素促进多柔比星诱导肝癌细胞SMMC7721凋亡的研究〔J〕.实用肿瘤杂志，2006;21(5):412-6.

6 梁 军，宋晓玉，刘志新，等.五味子乙素对人胃癌细胞株MGC-803凋亡的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(1):88-90.