陈 思 陈梅晞 龙冠晗 周 燕 (桂林医学院附属医院呼吸内科，广西 桂林 541000)

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAHS)是一种睡眠呼吸障碍性疾病，发病率逐年升高，已成为危害人类健康的主要疾病之一。关于OSAHS的发病机制目尚未完全明确，但大量研究证实在OSAHS患者中存在严重脂肪代谢紊乱，其中由脂肪细胞分泌的细胞因子不仅调节糖脂代谢，还参与炎症反应、免疫应答〔1〕。虽然对于体内脂肪细胞的来源一直存有争议〔2〕，但前脂肪细胞作为一种基质细胞，具有分裂增生和向脂肪细胞分化的能力是毋庸置疑的〔3〕。为深入探索脂肪细胞分化调节机制对OSAHS的影响，有必要确立稳定的原代培养前脂肪细胞以及诱导分化为成熟脂肪细胞的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 桂林医学院动物中心清洁级6 w雄性SD大鼠，体重约200 g左右。

1.1.2 主要实验试剂和仪器 DMEM/F12(1∶1)细胞培养液(Hyclone公司 美国);高糖DMEM细胞培养液(Hyclone公司美国);胎牛血清(Hyclone公司美国);Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶(Gibco公司美国);3－异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、地塞米松、胰岛素、油红O、PI、RNA酶均购自美国Sigma公司。

1.1.3 主要试剂配置 基础培养液:将10 ml胎牛血清加入90 ml DMEM/F12(1∶1)细胞培养液中，4℃保存。促分化液1:在高糖DMEM细胞培养液中，分别加入1 μmol/L地塞米松、10 mg/L胰岛素、0.5 mmol/L IBMX，pH 值调至7.2，4℃保存。促分化液2:高糖DMEM细胞培养液中加入10 μg/ml胰岛素，pH值调至7.2，4℃保存。消化液的配置:Ⅰ型胶原酶100 mg，溶于50 ml PBS中，过滤除菌，分装后－20℃保存。1%油红O原液:称取0.4 g油红O粉末，加入40 ml异丙醇，充分溶解后室温保存备用。油红O工作液:6 ml 1%的油红O原液加入4 ml三蒸水，混匀后过滤，2 h内使用。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠前脂肪细胞的原代培养 改良von Heimburg等〔4〕方法，将大鼠断颈处死，无菌条件下取出附睾及肾周围脂肪垫，转入超净工作台，冷磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍，去除肉眼可见的血块和纤维组织。将脂肪垫转移至装有DMEM/F12(1∶1)细胞培养液的新培养皿中，眼科剪剪成1 mm3的小块，加入等体积2 mg/mlⅠ型胶原酶，37℃水浴振荡消化90 min，直至乳糜状液体。将消化后的液体用200 μm孔径的细胞筛过滤，1 200 r/min，8 min离心2次，所得沉淀细胞用5 ml基础培养基重悬，接种于培养瓶内，放入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.2.2 大鼠前脂肪细胞增殖活性的测定 取对数生长期的原代前脂肪细胞，常规消化收集细胞，预冷70%乙醇固定，－20℃保存。使用前1 600 r/min离心10 min弃去固定液，预冷PBS洗涤2次，400 μl RNA酶悬浮细胞。37℃水浴1 h后，用100 μl PI染液避光孵育30 min，FACSCalibar流式细胞仪进行细胞周期检测，Misfit LT 2.0软件进行结果分析。

1.2.3 大鼠前脂肪细胞的诱导分化 取3代内生长至80%融合的前脂肪细胞，促分化液1培养3 d，隔天换液。3 d后换促分化液2培养5 d，隔天换液。

1.2.4 油红O染色 取诱导成功的脂肪细胞，用PBS洗3次，10%甲醛固定10 min;PBS洗3次，细胞晾干20 min，加油红O工作液静止10 min后，弃油红O;加60%异丙醇洗分色，自来水冲洗，封片。

2 结果

2.1 大鼠前脂肪细胞形态学观察 前脂肪细胞刚刚接种时呈类圆形，悬浮于培养基中，24 h可贴壁;3 d后细胞伸展，渐成梭形或多角梭形;6 d左右进入指数增长期，呈漩涡状或鱼群状。见图1。

2.2 大鼠前脂肪细胞增殖活性 流式细胞仪检测细胞周期发现:G1+G0期细胞数占总数的79.7%，DNA含量平均值为75.77;G2期细胞数占总数的11.6%，DNA含量平均值为149.27;S期细胞数占总数的8.7%。

2.3 大鼠前脂肪细胞诱导分化及鉴定 对3代以内80%融合的前脂肪细胞换用促分化液1诱导培养3 d，细胞增殖停止，形态由梭形或多角梭形变为圆形，胞膜皱缩，胞浆内出现散在的反光颗粒，大小不等。3 d后换用促分化液2，细胞内的反光颗粒逐渐增多、增大，成葡萄串状，将细胞核推向一侧。培养7 d，反光颗粒融合充满细胞。经油红O染色，胞浆内的反光颗粒着橘红色，可以鉴定前脂肪细胞已分化为成熟脂肪细胞。见图2。

图1 前脂肪细胞培养1 d、3 d(×200)

图2 不同诱导时间脂肪细胞分化情况

3 讨论

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)作为一种代谢性疾病，与肥胖、糖尿病及各种心脑血管疾病关系密切，这些疾病之间存在了一个共同的病生理机制，即脂质代谢的紊乱。近年来脂肪细胞的增殖分化、代谢调节已成为研究热点，国外多采用3T3-L1前脂肪细胞株作为研究模型，体外诱导分化〔5〕。但细胞珠传代后会出现不同性状改变及增殖分化率的下降。因此本研究选择原代培养大鼠前脂肪细胞，取材方便，价格适中，性状保持稳定，实验处理因素比较少，从而获得大量成分均一具有高增殖能力的前脂肪细胞。

3.1 前脂肪细胞的原代培养 关于大鼠前脂肪细胞的原代培养方法，虽然在很多文献中均有提及，但本实验确立了一种比较稳定的培养方法。在分离脂肪组织时，尽力避开纤维及血丝，保持组织成分单一;同时选择在细胞培养液中剪碎，从而达到保护细胞提高成活率的作用。Ⅰ型胶原酶对组织进行消化的时间过短，细胞不能完全释放，消化时间过长则会损伤细胞的活性;同时在37℃水浴晃动，不但能提高酶的活性，而且可增加组织与酶的接触面积，减少酶作用时间过长对细胞的损伤〔6〕，最终确立90 min为最佳消化时间。

3.2 前脂肪细胞的增殖活性 本研究发现原代大鼠前脂肪细胞G1期，细胞DNA复制还没有开始，也是DNA含量最少的，流式检测结果图的第1个峰;S期是一个1倍DNA到2倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大但不高;而G2期是DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含2倍DNA，在流式结果图中的第2个峰，从而提示大鼠原代的前脂肪细胞具有继续分裂增殖的能力，细胞活性好。

3.3 前脂肪细胞诱导分化与鉴定 在诱导分化前脂肪细胞时本实验使用了两种无血清的促分化液。因为血清中含有大量生长因子，促进细胞增殖，若诱导时添加血清，即使胞浆内有脂滴生成但细胞形态仍为长梭形，不利于对细胞分化过程的把握。在促分化液1中，IBMX、胰岛素和地塞米松共同发挥最大诱导效率，促进脂肪细胞由葡萄糖合成脂质的过程。3 d后长梭形前脂肪细胞分化为圆形，胞浆内开始充脂，此时已不需要大量脂肪细胞增殖基因的表达，因此换用仅含胰岛素的促分化液2维持分化增加成脂率，最终成功诱导前脂肪细胞为脂肪细胞。原代培养的细胞成分较复杂，必须对所培养的细胞进行鉴定，油红O染色可以简便快速地测定体外培养前脂肪细胞的转化率，因此本研究采用该方法鉴定前脂肪细胞向脂肪细胞的分化情况。

前脂肪细胞位于成熟的脂肪组织之中，能在体外扩增，具有定向分化为脂肪细胞的能力〔7，8〕。本研究成功建立了一种稳定高效的原代培养大鼠前脂肪细胞及诱导分化的方法，确立了优良的以脂肪细胞为载体的研究模型，为OSAS等相关代谢性疾病发病机制的研究奠定了基础。

1 Rosen ED，Spiegelman BM.Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis〔J〕.Nature，2006;444(7121):847-53.

2 Billon N，Monteiro MC，Dani C.Developmental origin of adipocytes:new insights into a pending question〔J〕.Biol Cell，2008;100(10):563-75.

3 Shahparaki A，Grunder L，Sorisky A.Comparison of human abdominal subcutaneous versus mental preadipocyte-differentiation in primary culture〔J〕.Metabolism，2002;51(9):1211-5.

4 von Heimburg D，Kuberka M，Rendchen R，et al.Preadipocyte-loaded collagen scaffolds with enlarged pore size for improved soft tissue engineering〔J〕.Int J Artif Organs，2003;26(12):1064-76.

5 Koh YJ，Kang S，Lee HJ，et al.Bone marrow-derived circulating progenitor cells fail to transdifferentiate into adipocytes in adult adipose tissues in mice〔J〕.J Clin Invest，2007;117(12):3684-95.

6 Fried SK，Moustaid-Moussa N.Culture of adipose tissue and isolated adipocytes〔J〕.Methods Mol Biol，2001;155:197-212.

7 Stacey DH，Hanson SE，Lahvis G，et al.In vitro adipogenic differentiation of preadipocytes varies with differentiation stimulus，culture dimensionality，and scaffold composition〔J〕.Tissue Eng Part A，2009;15(11):3389-99.

8 Stillaert FB，Di Bartolo C，Hunt JA，et al.Human clinical experience with adipose precursor cells seeded on hyaluronic acid-based spongy scaffolds〔J〕.Biomaterials，2008;29(29):3953-9.