王 蕾，李燕辉，吴士茜，尹晓玲，牛丽辉，秦景云

雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone reeeptor，PR)和人类表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factor receptor 2，HER －2)均是阴性的乳腺癌，称为三阴乳腺癌(triple negative breast cancer，INBC)，是最近几年被提出来的一种乳腺癌亚型。此类乳腺癌具有侵袭力强、复发早、远处转移风险高和预后差等特点。由于目前对于此种类型的乳腺癌无针对性治疗指南，化疗是惟一的治疗方法，但是整体疗效不理想。本研究拟用免疫组织化学SP 法检测三阴乳腺癌组织中Notch1、Wnt1 的表达情况，旨在进一步了解癌基因蛋白与三阴乳腺癌预后的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2008—2011 年在河北工程大学附属医院手术治疗并获得明确病理诊断，且免疫组织化学检测ER、PR和Her－2 均为阴性的56 例乳腺癌患者作为研究对象，均为女性，年龄28 ～75 岁，中位年龄46 岁，患者术前未进行任何治疗。所有手术标本统一重新切片HE 染色确定病理诊断，临床病理资料齐全。56 例乳腺癌患者中39 例伴淋巴结转移;其中浸润性导管癌导管内癌33 例，浸润性小叶癌23 例。参照Elston等［1］方法并进行改良，对56 例乳腺癌进行分级:Ⅰ级15 例，Ⅱ级20 例，Ⅲ级21 例。按照第6 版AJCC 分期:Ⅰ期8 例，Ⅱ期7 例，Ⅲ期22 例，Ⅳ期19 例。标本常规取材，10%甲醛固定，石蜡切片(4μm)，常规HE 染色。选择同期30 例患者的癌旁正常组织作为对照组。

1.2 方法 兔抗人Notch1 抗体和兔抗人Wnt1 抗体，即用型SP 试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组化染色SP 法。微波抗原修复，免疫组化染色过程按试剂盒说明操作，苏木精衬染。

1.3 结果判定 用已知阳性的胃癌组织作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。光镜下观察，Notch1 阳性表达主要定位于细胞质和细胞核，部分定位为细胞膜，Wnt1 阳性表达定位于细胞质，呈棕黄色颗粒。计数1000 个肿瘤细胞，阳性细胞数＜5%为(－)，≥5%且＜25%为(+)，≥25%且＜50%为(+ +)，≥50%为(+ + +)。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0 统计软件进行数据处理，计数资料采用χ2检验，并采用Spearman 进行等级相关分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Notch1、Wnt1 在三阴乳腺癌组织和正常组织中的表达 Notch1 在三阴乳腺癌组织中的阳性表达率为62.5% (35/56)，在正常组织中的阳性表达率为3.3% (1/30);Wnt1 在三阴乳腺癌组织中的阳性表达率为53.6% (30/56)，在正常组织中的阳性表达率为3.3% (1/30)。两者在三阴乳腺癌组织中的阳性表达率分别与正常组织比较，差异均有统计学意义(P ＜0.05)。

2.2 两种蛋白在三阴乳腺癌组织中的表达与临床病理指标的关系 Notch1、Wnt1 在三阴乳腺癌组织的表达中，肿瘤的大小、病理分级、cTNM 和淋巴结转移情况比较，差异均有统计学意义(P ＜0.05，见表1)。

2.3 三阴乳腺癌中两种蛋白分子表达的关系 Spearman 等级相关性分析结果表明:Notch1 与Wnt1 的表达呈正相关(r =0.671，P=0.000)。

表1 Notch1、Wnt1 的表达与临床病理指标的关系(例)Table 1 Relationship of Notch1，Wnt1 expression and clinical pathological parameters

3 讨论

Notch 是基因编码一类大的跨膜Notch 受体，在哺乳动物中Notch 受体有4 种:Notch1 ～Notch4。这些受体有5 个配体，Delta 样分子1、3、4 以及Jagged 1、2。一个完整的Notch 信号通路包括:Notch 受体、配体、CSLDNA 结合蛋白(CBF－1/RBP－Jκ、Hairless 抑制基因和Lag－1 的合称)以及其他效应物等构成［2］。有研究发现，Notch 信号不仅影响细胞的增殖、分化、凋亡、黏附和上皮细胞－间叶细胞转化，并且在胚胎发育、血管生成、某些神经系统疾病及肿瘤形成等过程中起着重要的作用［3］。

在许多人类肿瘤中如:宫颈癌、结肠癌、肾细胞癌等可有Notch 信号表达异常。在人类恶性肿瘤中，Notch1 作用可以是抑癌基因或是癌基因，其机制是:(1)Notch 信号通路是其他细胞信号通路的交点，许多不同的刺激可激活Notch 通路;(2)Notch 的配体和靶基因不同，在不同组织、肿瘤发展的不同阶段，其作用也可能是不同的;(3)Ras 和Wnt 通路通过激活Notch 途径调节细胞生长［4］。在人类乳腺癌中Notch1 更多的是起到癌基因的作用，在乳腺癌细胞系可见Notch1 和Notch4 的激活形式。Dontu 等［5］认为，Notch1 的激活可以使乳腺干细胞自我更新。在三阴乳腺癌中，高表达的Notch1 可降低患者术后5 年生存率，敲除Notch1 基因可以提高患者对化疗的敏感性。本研究也发现，三阴乳腺癌组中Notch1 的表达明显高于正常乳腺组织，并且随着病理分级增高其表达也随之增强。此外，Notch1 表达与肿瘤大小、临床分期有关。

Wnt1 也叫int－1，在鼠乳腺癌病毒诱导的乳腺癌中，无翅有关的鼠乳腺肿瘤病毒整合位点1 作为原癌基因发现的。Wnt 糖蛋白通过结合到卷曲蛋白－低密度脂蛋白受体相关蛋白(frizzled－low density lipoprotein receptor －related protein，Frizzled－LRP)5/6 复合物来调节内稳态和发育。Wnt 信号途径包括经典的Wnt 信号途径和非经典的Wnt 信号途径，两者形成负反馈环路。研究认为，经典通路与肿瘤的发生发展关系密切，有许多肿瘤包括头颈部肿瘤、食管癌、胃癌、白血病、基底细胞癌等中都有Wnt1 的异常表达［6］。其致癌机制是:Wnt蛋白作用于细胞膜上的受体，信号传入细胞后，糖原合成酶激酶－3β (glycogen synthase kinase －3β，GSK －3β)被Wnt 信号抑制，导致β 连环蛋白(β－catenin)的降解被中断，细胞质内游离的β－catenin 含量增加，异位进入细胞核，作用于T细胞因子/淋巴样增强因子(T cell factor/lymphocyte enhancer factor，TCG/LEF)，形成转录复合物，激活Wnt 信号途径中的靶基因，调控细胞的生长、分化和凋亡［7］。在Wnt1 转基因鼠的肿瘤模型中，Wnt1 信号的激活与乳腺癌进展密切相关，Wnt1 小干扰RNA (small interference，sRNA)或抗Wnt1 抗体诱导细胞凋亡，抑制肿瘤生长。本研究发现，三阴乳腺癌组织中Wnt1 的阳性表达与组织分级、病理分期和淋巴结转移有关，与肿瘤的大小和患者的年龄无关。Wnt1 在三阴乳腺癌的阳性表达明显高于癌旁正常组织。

研究发现Wnt 和Notch 信号通路有交互作用 (cross －talk)，Wnt 蛋白通过与Notch 受体结合调控下游基因的表达，在乳腺癌形成过程中起协同作用。果蝇翅细胞中，Wnt 信号通过减轻Notch 的作用来促进G1 － S 期进展。我们对Notch1、Wnt1 在三阴乳腺癌组织中阳性表达进行相关性研究，发现二者呈正性相关。

总之，Notch1、Wnt1 在三阴性乳腺癌的发生、发展过程中存在一种相辅相成的作用，协同作用下促进肿瘤的发生，两者的联合检测有助临床对TNBC 的研究，具有一定现实意义。

1 Elston CW，Ellis IO． Pathological prognostic factors in breast cancer．I． The value of histological grade in breast cancer:experience from a large study with long － term follow － up ［J］． Histopathology，2002，41 (3A):154 －161．

2 Wang J，Fu L，Gu F，et al． Notch1 is involved in migration and invasion of human breast cancer cells ［J］． Oncol Rep，2011，26 (5):1295 －1303．

3 Leong KG，Karsan A． Recent insights into the role of Notch signaling in tumorigenesis ［J］． Blood，2006，107 (6):2223 －2233．

4 Qi R，An H，YuY，et al． Notchl signaling inhibits growth of human hepatocellular carcinoma through induction of cell cycle arrest and apoptosis ［J］． Cancer Res，2003，63 (23):8323 －8329．

5 Dontu G，El － Ashry D，Wicha MS． Breast cancer，stem/progenitor cells and the estrogen receptor ［J］． Trends Endocrinol Metab，2004，15 (5):193 －197．

6 Castilho RM，Squarize CH，Chodosh LA，et al． mTOR mediates Wnt－induced epidermal stem cell exhaustion and aging ［J］． Cell Stem，2009，5 (3):232 －234．

7 Duan J，Gherghe C，Liu D，et al． Wnt1/βcatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair［J］． EMBO J，2011，31 (2):429 －442．