郑 峥，赵艳男，路 明

心肌纤维化(myocardial fibrosis)是充血性心力衰竭的病理学基础，近年来人们逐渐认识到，心肌纤维化在心力衰竭的发生和发展中起十分重要的作用［1］。血液中B 型钠尿肽(BNP)现已作为心力衰竭的诊断和判断预后的重要指标［2］，但BNP，特别是心肌组织中的BNP 表达与心肌纤维化的关系报道尚少，本研究通过异丙基肾上腺素(ISO)诱导的慢性心肌纤维化大鼠模型进行初步研究，并探讨第三代非选择性β －受体阻断剂卡维地洛通过抑制心肌纤维对血浆BNP 水平和心肌BNP mRNA 表达的干预作用。

1 材料与方法

1.1 一般材料 雄性Sprague Dawley (SD)大鼠46 只，体质量100 ～150g，由徐州医学院动物中心提供;ISO 注射液(上海和丰制药有限公司);卡维地洛片剂(北京巨能制药有限责任公司);大鼠BNP ELISA 试剂盒(产品编号E02B0452，蓝基生物制品有限公司);Trzol 提取液及RT －PCR 两步法试剂盒(北京天根生物工程有限公司);引物(上海生工生物工程有限公司);Thermo Scientific Multiskan Spectrum 酶标仪;PCR仪;紫外线成像分析系统;CISA－1000 计算机图像分析系统。

1.2 动物分组及给药 将46 只健康雄性SD 大鼠随机分为4周模型组(n=10)、8 周模型组(n =9)、卡维地洛组(n =11)，4 周对照组(n=8)和8 周对照组(n =8)。4 周模型组、8 周模型组、卡维地洛组参考Rona 等的方法［3］，以10mg·kg－1·d－1剂量皮下多点注射ISO，连续治疗7d，4 周及8 周对照组给予皮下0.9%氯化钠溶液替代ISO。至4 周心肌纤维化模型形成，4 周模型组大鼠死亡1 只，卡维地洛组大鼠死亡2 只，将4 周模型组剩余者和4 周对照组大鼠处死。卡维地洛组开始给予卡维地洛10mg·kg－1·d－1灌胃，每周测1 次体质量调整剂量，共4 周。8 周模型组和8 周对照组同时给予等量蒸馏水灌胃。至8 周时8 周模型组死亡1 只，卡维地洛组和8周对照组全部存活，处死所有存活大鼠。

1.3 血液及组织标本的留取 动物处死前称重 (BW)，0.3%水合氯醛腹腔注射麻醉下心脏采血3ml，然后将动物处死，完整切取心脏，冰盐水冲洗。称量心脏质量(HW)，计算心重指数(HWI =HW/BW)。切取部分左室心肌用10%甲醛固定，剩余左心室组织置－80℃冰箱保存待测。

1.4 心肌组织学观察、胶原容积分数(CVF)的测定 心肌组织置于4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，切片经MASSON 染色，用CISA－1000 计算机图像分析系统进行分析。在MASSON 染色切片上每鼠随机取6 个视野，采用测量CVF。

1.5 血清BNP 的检测

1.5.1 血清采集 将抽取的血液标本注入无抗凝剂的真空采血管中混匀，迅速4℃离心20min (转速1000r/min)，取上层血清，置－80℃冰箱保存。测定时，将标本置室温复融混匀，同上离心5min，取上清液。

1.5.2 BNP 测定 采用竞争性抑制法酶联免疫吸附测定法(ELISA)，加入待测样本和酶联亲和物共同竞争包被在微孔板上抗体的定量结合位点。反应后冲洗掉未结合的部分，再加入底物反应，底物在酶的作用下变为蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。通过测定吸光度来绘制标准曲线，并根据标准方程计算出待测样本的浓度。结果单位为pg/ml，最小可测值为1.0pg/ml。

1.6 RT－PCR 法检测心肌组织BNP mRNA 的表达

1.6.1 总RNA 的提取 取50 ～100mg 大鼠心肌组织，用TRizol 试剂一步法提取总RNA，溶解于35μl RNase － free ddH2O中，测定浓度后保存于－80℃。

1.6.2 反转录反应(reverse transcription，RT)两步法 RNA 5μl，Oligo (dT)15 (天根生物工程有限公司)2μl、超纯Dntp (2.5mMeach)(天根生物工程有限公司)2μl、补RNase－free ddH2O 定容至14.5μl 70℃加热5min 后迅速冰上冷却2min。简单离心收集反应液后加入5 ×First －Strand Buffer (含DTT)(天根生物工程有限公司)4μl、0.5μl RNasin、TIANScript M－MLV (天根生物工程有限公司)1μl (200U)，42℃温浴50min，95℃加热5min 终止反应。

1.6.3 PCR 反应 cDNA 2.5μl、2 ×Master MIX 12.5μl (天根生物工程有限公司)，BNP 上游引物5' －cctgcttttccttaatctgtcg －3'和下游引物5' － gcttgaactatgtgccatcttg －3'各1μl，GAPDH 上游引物5' －CCAAAAGGGTCATCATCTCC －3'和下游引物5' －CAACCTGGTCCTCAGTGTAGC － 3' 各1μl，补RNase － Free ddH2O 至25μl 体积。PCR 反应条件为:BNP 预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，循环34次后72℃延伸7min。GAPDH 的反应条件为预变性94℃5min，变性94℃30s，退火60℃30s，延伸72℃30s，循环34 次后72℃延伸7min。

1.6.4 琼脂糖电泳 PCR 产物于2%琼脂糖凝胶电泳，BNP 259bp，GAPDH 498pb。在紫外灯下照相，用图像分析处理系统进行灰度扫描，做扫描面积积分半定量分析，以GAPDH 作为内参照，比较各组BNP/GAPDH 比值。

1.7 统计学方法 应用SPSS16.0 统计软件进行数据处理，计量资料以(± s)表示，多组比较采用单因素方差分析，组间比较采用独立样本t 检验，相关性采用直线相关分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ISO 诱导的心肌纤维化大鼠模型 注射ISO 后大鼠开始出现食欲不振、倦怠少动、体质量增长缓慢、呼吸困难等表现，至4 周时，光镜下观察右心室心肌切片MASSON 染色示心肌细胞有明显的排列紊乱，并出现心肌纤维的断裂、分叉，部分肌质溶解，出现空泡;而正常对照组心肌细胞排列整齐，可见细胞间隙。至8 周时，心肌纤维化更为明显，心肌纤维杂乱无章，大量断裂肌纤维分布于视野中。卡维地洛组虽心肌细胞也有排列紊乱、肌纤维断裂现象，但较8 周模型组相比视野中的不规则肌纤维范围稍小(见图1)。

图1 各组大鼠心肌组织病理学观察结果(MASSON 染色，×400)Figure 1 Result of pathological myocardial tissue each rats group

2.2 大鼠CVF、HWI、血清BNP、心肌组织BNP mRNA 的变化 (1)和4 周对照组比较，4 周模型组大鼠HWI 和CVF、血清BNP、心肌组织BNP mRNA 值比较，差异有统计学意义(P ＜0.01)。(2)8 周对照组和8 周模型组大鼠HWI 和CVF、血清BNP、心肌组织BNP mRNA 值比较，差异有统计学意义(P ＜0.01)。(3)8 周模型组与4 周模型组大鼠HWI 和CVF、血清BNP、心肌组织BNP mRNA 值比较，差异有统计学意义(P ＜0.01，见表1、图2)。

2.3 卡维地洛干预作用 心肌纤维化后连续用药4 周的卡维地洛组和8 周模型组大鼠CVF 和HWI、血清BNP 和心肌BNP mRNA 表达值比较，差异有统计学意义(P ＜0.01，见表1、图2)。

2.4 相关性分析 模型组大鼠血清BNP 和BNP mRNA 表达水平呈正相关(r=0.647 ，P ＜0.01，见图3)。

表1 各组大鼠HWI、CVF、血清BNP 和心肌BNP mRNA 表达值的比较(±s)Table 1 Comparison of HWI，CVF，serum BNP and myocardial BNP mRNA expression value each rat group

表1 各组大鼠HWI、CVF、血清BNP 和心肌BNP mRNA 表达值的比较(±s)Table 1 Comparison of HWI，CVF，serum BNP and myocardial BNP mRNA expression value each rat group

组别 只数 HWI CVF(%) 血清BNP(ng/L)心肌BNP mRNA 4 周对照组8 3.12±0.11 2.75±0.25 160.2±29.5 0.39±0.05 4 周模型组 9 4.30±0.07 12.83±0.21 411.8±65.6 0.87±0.06 8 周对照组 8 3.48±0.15 2.89±0.24 180.7±25.2 0.52±0.04 8 周模型组 8 5.23±0.07 18.66±0.32 637.0±76.6 1.25±0.28卡维地洛组9 4.57±0.48 15.31±0.24 473.2±53.3 0.87±0.03

图2 5 组心肌BNP mRNA 的表达Figure 2 The expression of myocardial BNP mRNA in 5 groups

图3 模型组大鼠血清BNP、心肌BNP mRNA 灰度值的相关性Figure 3 The correlation between the model group rats serum BNP，myocardial BNP mRNA gray value

3 讨论

心肌纤维化是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变，是心肌重塑的主要表现，是心力衰竭的发生和发展重要的病理学基础，心肌细胞外基质中胶原纤维过量积聚、胶原浓度明显升高或胶原容积分数明显高于正常为其主要特征［4］。现在的研究认为，除肾素－血管紧张素－醛固酮系统的作用外，交感－肾上腺素能系统在导致心肌纤维化的神经内分泌因素中也占有重要地位，给大鼠长期注射β－受体激动剂可导致导致大鼠左室质量增加、左室蛋白含量及β－重链肌球蛋白水平提高、左室肥厚和心肌纤维化［5］。本实验根据Rona 等人方法略作修改，给予雄性SD 大鼠皮下注射ISO 10mg/kg，连续7d，4周后通过对大鼠心肌组织学观察、测CVF 增加证实胶原的增生，表明模型心肌纤维化成功。

BNP 是1988 年日本学者Sudoh 首先从猪脑中分离出来的，属利钠多肽系统。心脏中BNP 的水平最高，其合成分泌的主要部位是心室［6］。BNP 是在维持机体内环境水盐平衡、血压稳定、调节心血管功能中具有重要意义的一种多肽。有研究表明，其增高程度和心力衰竭的严重程度相关。正常情况下心室中存在低水平的BNP mRNA，表达的BNP 前体也直接进入血液分解成了具有生物学活性的BNP，而在急性心肌损伤时，心室的BNP mRNA 水平会明显提高［7］。本研究结果显示ISO 注射4 周后模型组大鼠心肌发生了纤维化，BNP 水平和BNP mRNA 的表达均明显高于4 周对照组，血清BNP 水平与心肌BNP mRNA 呈正相关，表明血清BNP 可以反映心肌BNP mRNA 表达水平，而8 周组BNP 水平及其mRNA 的表达增高更为明显，也进一步说明在心肌纤维化的发展过程中，机体合成和分泌BNP 的能力是在持续增加的，这可能是心肌细胞应对损伤导致心肌纤维化的重要代偿机制。

卡维地洛是一种新一代非选择性β－受体阻滞剂，能改善心力衰竭患者心室功能、增加心脏指数、降低心缩力、减少心脏做功和心肌耗氧量。治疗心力衰竭患者也可使BNP 水平降低，用卡维地洛治疗肾动脉结扎导致的大鼠心肌肥厚，可逆转升高的BNP 蛋白和其mRNA 表达［8］。在本研究中，卡维地洛使心肌纤维化的病理学表现有所缓解的同时，也明显降低了心肌纤维化大鼠升高的血清BNP 水平，表明卡维地洛的治疗作用可能也对BNP 产生了影响。BNP 作为心脏疾病特别是心肌纤维化的早期诊断、分级及转归的指示剂具有广泛的发展前景。关于BNP 在心肌纤维化中的作用及变化机制的进一步研究，可能为今后治疗心肌纤维化及其心力衰竭提供新的思路。

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