许亦峰，罗晓蕾，施碧红

(福建师范大学生命科学学院，福建福州 350108)

枯草芽胞杆菌在发酵过程中能够产生多种有抑菌活性的蛋白、多肽等代谢抗菌物，其中由核糖体合成的蛋白或多肽类抗菌物又称细菌素［1］，不少由枯草芽胞杆菌产生的细菌素已被用于医药、食品、化工、农业生物防治、水产养殖等领域［2］。对枯草芽胞杆菌产生的粗细菌素进行分离纯化，获得单一的有活性的抗菌物，是进一步研究特定细菌素的结构与功能关系的前提。纯化的难点之一是对目标物的浓缩，尽快除去杂质。建立选择性抽提和浓缩方法是关键。目前粗提细菌素常用的方法有硫酸铵沉淀法，酸沉淀法，有机溶剂抽提法等［3-4］。粗提方法的选择要根据待纯化的目的细菌素的性质确定，粗提方法选择的好坏直接影响细菌素的回收率和纯化效率。本研究对枯草芽胞杆菌产生的细菌素粗提方法进行比较分析，为后续的纯化及结构鉴定等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 试验菌:Bacillus subtilisFB123，本实验室分离鉴定并保存［5］;指示菌:大肠埃希菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等，由本学院微生物实验室提供。

1.1.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏0.3%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%，pH 7.0～7.2。

1.2 方法

1.2.1 粗细菌素的制备 将枯草芽胞杆菌发酵液经8 000 r/min，4℃，离心10 min，去菌体，获发酵上清液。将发酵上清液等体积分成2份，分别按照硫酸铵沉淀和酸沉淀的方法进行沉淀，离心获得粗细菌素，用等体积的pH为6.5、0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液溶解粗细菌素，收集粗细菌素。①硫酸铵沉淀法:在发酵上清液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，置4℃冰箱过夜沉淀。次日于9 000 r/min，4℃离心20 min，去上清，将沉淀用pH为6.5、0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液溶解后置于－20℃冰箱保存备用;②酸沉淀法:用浓HCl溶液将发酵上清液的pH值调为2.0，4℃过夜沉淀，第2天于9 000 r/min，4℃离心20 min，倾去上清液，沉淀用 pH 为6.5、0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液溶解后置于－20℃备用。

1.2.2 各种有机溶剂抽提细菌素效果比较 将上述硫酸铵沉淀和酸沉淀得到的粗细菌素，分别取一定体积到EP管中，每管分别加入等体积的正丁醇，甲醇，三氯甲烷，甲醇和三氯甲烷的混合抽提液，10℃，180 r/min，振荡2 h。振荡结束后，9 000 r/min，4℃，离心15 min，倾去有机溶剂。将装有抽提细菌素的EP管放入通风橱中干燥，同时设立等体积的有机溶剂做对照，用于排除粗提物中残留的有机溶剂的影响。将细菌素抽提物，加入200 μL的磷酸盐缓冲液，进行梯度稀释，以大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌，用玻璃平板法进行抑菌试验。用考马斯亮蓝法测定细菌素粗提物的蛋白浓度。

1.2.3 细菌素的活性测定-玻璃平板法 采用改进后玻璃平板法［6］，将指示菌悬液加入到牛肉膏蛋白胨培养基中至终浓度约5×105cfu/mL，混匀、倒玻璃平板，凝固后用5 mm打孔器打孔。每个孔中分别加入20 μL不同浓度的样品，以20 μL磷酸盐缓冲液为对照，置30℃培养24 h，观察、测定抑菌圈大小以及最低抑菌浓度，并估算其效价。其效价计算如下:效价(AU/mL)=1 mL/v×最大稀释倍数。式中:v表示平板中每个孔的加量，单位是μL。

1.2.4 Bradford 测定蛋白浓度 考马斯亮兰法［7］(Bradford法)是1976年由Bradford根据蛋白质与染料相结合能够发生颜色反应的原理设计的测定蛋白浓度的方法。配制系列不同浓度的牛血清蛋白(BSA)溶液，各加入适量考马斯亮兰G-250，分别测定其在595 nm下的吸光度，绘制蛋白质浓度对吸光度的标准曲线。测定未知蛋白质样品的吸光度，每个样品均设，3个平行样，根据标准曲线计算蛋白质的浓度。

2 结果与分析

确定合适的粗提方法是提高细菌素得率的关键步骤，为此本研究比较了不同沉淀法对枯草芽胞杆菌发酵液中细菌素的粗提效果。

2.1 硫酸铵沉淀和酸沉淀所得粗产物的比较

两种沉淀法获得的粗产物外观上差异较大(表1)，酸沉淀收集的粗产物呈黄色，较为粘稠;硫酸铵沉淀法获得的粗产物仅淡黄色，较澄清。上清液中残留的产物差异也很大，硫酸铵离心后的上清仍很浑浊，而酸沉淀的上清显得较为澄清，说明酸沉淀法能够更加有效地沉淀目标产物，残留在上清中的产物较少。以上结果初步表明酸沉淀法是浓缩沉淀细菌素的更为有效的方法。

表1 两种沉淀法获得的粗细菌素外观的比较Table1 Comparison of the appearance of the crude bacteriocin obtained by two kinds of precipitation method

进一步对粗产物的蛋白含量进行分析。测定待测样品在595 nm波长下的光吸收值，参照标准曲线(y=0.035 7x+0.038 8，R2=0.990 2)，计算待测样品蛋白的含量。酸沉淀和硫酸铵沉淀法所获粗产物中蛋白浓度如表2所示。

由表2可以看出利用酸沉淀法，比硫酸铵沉淀法沉淀粗蛋白的量提高了28.66%，酸沉淀的得率为49.04%，高于硫酸铵沉淀法的得率38.12%，是一种更加有效的沉淀细菌素的方法。

2.2 硫酸铵沉淀法和酸沉淀法粗产物活性的比较

活性是评价一种纯化方法最重要的指标。取等体积的硫酸铵沉淀物及酸沉淀物，测定其蛋白浓度、最大抑菌倍数，分别计算酸沉淀和硫酸铵沉淀所得沉淀物的效价，总活性等。结果如表3所示。

表2 两种沉淀法所得粗细菌素中的蛋白含量Table2 The protein content of the crude bacteriocin obtained by two kinds of precipitation method

表3 两种沉淀方法的细菌素活性比较Table3 Comparison on the activity of the bacteriocin obtained by two kinds of precipitation method

结果表明，酸沉淀所得粗产物的单位效价是硫酸铵沉淀法的2倍，且酸沉淀所得产物的比活性提高了55.46%。另外利用酸沉淀法还可以减少操作体积，简化纯化步骤，同时也避免了硫酸铵沉淀法所带来的盐离子浓度太高的影响，是一种针对细菌素较理想的沉淀方法。

2.3 不同有机溶剂抽提粗细菌素的效果比较

将硫酸铵沉淀和酸沉淀得到的粗细菌素，分别加入等体积的正丁醇，甲醇，三氯甲烷，甲醇和三氯甲烷的混合抽提液，振荡抽提后，离心收集粗细菌素。用考马斯亮蓝法测定各有机溶剂抽提所得粗细菌素的蛋白浓度，计算得蛋白总量。结果如图1所示。

由图1看出，不论是对硫酸铵沉淀物或酸沉淀物，三氯甲烷和混合抽提液的抽提效果都显著高于正丁醇或甲醇的抽提效果。特别是混合抽提液对酸沉淀物的抽提效果尤其显著，蛋白总量达6.24 mg，是正丁醇抽提同样沉淀物的5.2倍。这可能与混合抽提液含极性大小不一的有机溶剂，增加了对具有双极性的粗细菌素的溶解度，从而更加有效地抽提粗细菌素［8］。

图1 两种沉淀物分别用不同有机溶剂抽提粗细菌素的效果比较Fig.1 Comparison of the extraction effect of the crude bacteriocin by treatment two kinds of sediments with different organic solvents

有机溶剂能够有效地沉淀蛋白，但同时有机溶剂也会影响细菌素的活性，造成活性的损失。为此，研究观察了不同有机溶剂抽提粗细菌素沉淀物的效果与活性，结果如表4所示。

表4 不同有机溶剂抽提粗细菌素的蛋白总量及活性测定Table4 The protein content and the activity of the crude bacteriocin extracted by different organic solvents

从表4可以看出，用不同有机溶剂抽提等体积细菌素沉淀物，所获蛋白总量及活性均有很大差异。在选择某种有机溶剂时，应综合考虑抽提蛋白的质量和活性2个指标。用混合抽提液抽提粗细菌素的效果虽然好，蛋白总量最高(2.55 mg)，但是因此造成的活性损失也是最大的，其比活大约只有正丁醇提取物1/4。正丁醇能够较好地保持蛋白的活性(比活性为5 882 AU/mg)，但抽提的粗细菌素的含量很低;三氯甲烷抽提的比活性其次，比活性是正丁醇的一半，但是提取的细菌素的量是正丁醇的20倍，权衡考虑，采用三氯甲烷抽提细菌素的效果更好。

3 讨论

不同细菌素很难采用完全相同的分离纯化方法。针对纯化未知细菌素，抽提浓缩方法的选择是关键，灵活采用适当的粗提方法，可大大缩短纯化时间，提高纯化回收率。硫酸铵沉淀法的性质比较温和，不容易引起蛋白的失活，能够较大程度地保持蛋白的活性，是运用最广泛的沉淀方法［9］。本研究发现利用盐酸沉淀提取FB123枯草芽胞杆菌细菌素的方法，相对于传统的硫酸铵沉淀法能够更加有效的从发酵液中沉淀蛋白，提取细菌素的蛋白总量提高了28.66%，得率提高了10.92%，得到的粗细菌素的比活性提高了55.46%。酸沉淀法简便高效，较大程度地简化了纯化步骤，同时在粗提过程中没有引入盐离子，有利于后续的纯化步骤，是一种针对细菌素粗提的有效的沉淀方法。

利用酸沉淀法得到蛋白含量更高的原因有可能是:酸沉淀法能够将硫酸铵沉淀法所无法沉淀的蛋白或者多肽沉淀下来。硫酸铵法是利用在高离子强度的溶液中，增加了蛋白质疏水作用，趋于聚集，达到溶解极限时沉淀析出。枯草芽胞杆菌分泌的细菌素中有很大一部分是多肽，如脂肽或糖肽，分子量较小，硫酸铵沉淀法对于这样的肽类的沉淀效果不明显。利用酸沉淀法能够得到活性更大的细菌素粗提物的原因有可能是由于酸沉淀法是通过改变粗细菌素所处的pH环境，使蛋白或者多肽变性而达到析出的目的。酸沉淀法能够更加有效的沉淀发酵液中的多肽类物质，而这类物质由于分子量比较小，空间结构比较简单，性质比较稳定，不容易变性失活，当pH恢复中性条件时，能够较好地恢复活性。

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