牛海滨，郑玉林，万 平，杜 雯，胡佳英，胡鹏亭

(上海新亚药业有限公司，上海 201203)

万古霉素是由东方拟无枝酸菌发酵产生的一种糖肽类抗生素，由美国礼莱公司开发，1958年获FDA批准上市［1］。万古霉素一直被国际抗生素专家誉为“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”，通常不作为一线抗菌药物应用，只在常用抗菌药物无效时才应用。20世纪80年代随着β-内酰胺类抗生素的大量使用，由甲氧西林耐药金葡球菌(MRSA)所引起的感染逐渐流行，万古霉素是临床上用于治疗由MRSA引起的严重感染疾病的重要药物，越来越引起人们的重视，应用日渐增多。我公司在引进万古霉素发酵工艺的基础上，结合公司实际条件消化吸收再创新，经过充分调研分析，选择性的对工艺条件进行了优化改进，获得了较好的发酵效价和生产效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 上海新亚药业有限公司菌保中心实验室保藏菌种。

1.1.2 培养基 ①斜面培养基:葡萄糖1.0%，麦芽抽提物0.5%，酵母粉0.3%，蛋白胨1.5%，琼脂2.0%，消前pH 7.2±0.2，121℃ 20 min;②一级种培养基:酵母粉0.3%，麦芽抽提物0.6%，蛋白胨1.5%，葡萄糖2.0%，消前pH(7.4±0.2)，121℃ 20 min;③二级种培养基:豆粕0.8%，大豆粉0.5%，碳酸钙0.3%，淀粉3%，消前pH(7.7±0.2)，121℃ 20 min;④发酵培养基:大豆粉2.6%，豆粕1.8%，氯化钠0.2%，碳酸钙0.5%，葡萄糖2.5%，淀粉3%，消前pH(7.5±0.2)，121℃ 20 min。

1.1.3 仪器设备 超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、振荡摇床等。

1.2 方法

1.2.1 菌种培养与发酵 斜面培养:冷冻管菌种经分离纯化后接种于斜面培养基，28℃培养5 d。一级种子液培养:一级种培养基配制灭菌后，取新鲜培养好的菌种斜面，在无菌条件下，用无菌接种铲取一块菌种培养物，接入摇瓶一级种培养基，于28℃、220 r/min振荡培养24 h。二级种子液培养:二级种培养基配制灭菌后，取培养好的一级种培养液，在无菌条件下，吸取定量20 mL接入摇瓶二级种培养基，于28℃、220 r/min振荡培养48 h。发酵培养:发酵培养基配制灭菌后，取培养好的二级种培养液，在无菌条件下，吸取定量25 mL接入摇瓶发酵培养基，于28℃、220 r/min振荡培养5 d。

1.2.2 效价测定 采用高效液相分析HPLC法测定。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基的优化

2.1.1 碳源浓度的确定(葡萄糖、淀粉) 根据单因素优化实验方法，发酵培养基中其他成分保持不变，只改变葡萄糖的浓度，选择不同的浓度水平，考察葡萄糖因素对发酵结果的影响，确定最优的葡萄糖浓度。同样确定最优的淀粉浓度。以试验的最高效价为100%，其他效价与之相比较作为相对效价，以相应的碳源浓度为X轴，相对效价为Y轴作图，如图1、图2所示。以葡萄糖、淀粉作为碳源有利于万古霉素菌体发酵［2-3］。由图1、2可见，葡萄糖浓度为2.0%、淀粉浓度为2.0%时，万古霉素发酵效价水平最高。其中葡萄糖浓度在2.0%～3.0%时对发酵水平影响较小，淀粉浓度大于2.0%时，对发酵效价影响较小，在实际生产中配制培养基时应注意应用。确定最优的碳源浓度葡萄糖为2.0%、淀粉为2.0%。

图1 葡萄糖对万古霉素发酵效价的影响Fig.1 Effect of the glucose concentration on the fermentation titer of vancomycin

图2 淀粉浓度对万古霉素发酵效价的影响Fig.2 Effect of the starch concentration on the fermentation titer of vancomycin

2.1.2 氮源浓度的确定(豆粕、大豆粉) 试验方法同上，确定最优的豆粕浓度、大豆粉浓度。试验结果如图3、图4所示。氮源可调节微生物的生长速度及菌体量［4］。由上图3、4可见，豆粕浓度为2.2%、大豆粉浓度为2.2%时，万古霉素的发酵效价最高。当豆粕和大豆粉浓度大于2.2%时，发酵效价水平下降迅速，而小于2.2%时对发酵水平影响较小，因此在生产实践中配置培养基时，要严格控制两者的浓度水平不大于2.2%。确定最优的氮源浓度豆粕为2.2%、大豆粉为2.2%。

图3 豆粕浓度对万古霉素发酵效价的影响Fig.3 Effect of the soybean meal concentration on the fermentation titer of vancomycin

图4 大豆粉浓度对万古霉素发酵效价的影响Fig.4 Effect of the soybean flour concentration on the fermentation titer of vancomycin

2.1.3 无机盐浓度的确定(氯化钠、碳酸钙)试验方法同上，确定最优的氯化钠、碳酸钙浓度。试验结果如图5、图6所示。无机盐离子影响微生物的生理活性［5］。由上图5、6可见，氯化钠浓度为0.2%、碳酸钙浓度为0.2%时，万古霉素的发酵效价最高。其中氯化钠浓度对发酵效价影响不大，而碳酸钙浓度低于0.2%时，对发酵水平影响很大，在培养基配制中要注意控制。确定最优的无机盐浓度氯化钠为0.2%、碳酸钙为0.2%。

2.1.4 发酵培养基优化的正交试验 发酵培养基中影响发酵水平最重要的是碳源和氮源。根据单因素实验结果选取碳源葡萄糖、淀粉，氮源豆粕、大豆粉，设计4因素3水平正交表，进行菌种发酵培养基的优化试验［6-7］，因素水平表见表1。试验结果见表2。

图5 氯化钠浓度对万古霉素发酵效价的影响Fig.5 Effect of the sodium chloride concentration on the fermentation titer of vancomycin

图6 碳酸钙浓度对万古霉素发酵效价的影响Fig.6 Effect of the calcium carbonate concentration on the fermentation titer of vancomycin

从表2中极差项可以看出，以上4个因素对万古霉素发酵水平影响的强度依次为葡萄糖＞大豆粉＞豆粕＞淀粉，其中最佳试验结果为第6组，即最佳发酵培养基组成为葡萄糖2.0%，淀粉3.0%，豆粕1.8%，大豆粉2.2%，氯化钠0.2%，碳酸钙0.2%。将此配方培养基进行多次平行实验，产量较稳定，与原培养基比较，发酵效价水平提高11.2%。

2.2 发酵条件的优化

2.2.1 二级种接种量对发酵效价的影响 接种量与菌种的生长繁殖速度有关［8］。根据单因素优化实验方法，其他条件不变，分别将不同体积的二级种培养液(2%、5%、10%、15%)接入发酵培养基，考察接种量对发酵效价的影响。试验结果如图7所示。

表1 正交试验因素与水平Table1 Design table of factors and levels of the orthogonal experiment

表2 正交试验结果Table2 The result of L9(34)the orthogonal experiment

由图7可见，接种量为10%，万古霉素的发酵效价最高。随着接种量的增加，万古霉素发酵效价逐步升高，当接种量超过10%时，发酵水平开始下降。因此确定发酵的二级种接种量为10%。

2.2.2 装液量(溶氧)对发酵效价的影响 溶氧是万古霉素发酵控制的一个关键因素［9］。在摇床转速一定的情况下，以不同的发酵摇瓶装液量来表示菌株对溶氧的需求。其他条件不变，摇床转速为220 r/min，在250 mL三角瓶中分别装入不同体积(15、25、50、75 mL)的发酵培养基，考察装液量对发酵效价的影响，试验结果如图8所示。

图7 二级种接种量对万古霉素发酵效价的影响Fig.7 Effect of the inoculum of the second level’s seed liquid on the fermentation titer of vancomycin

图8 装液量对万古霉素发酵效价的影响Fig.8 Effect of the filling volume on the fermentation titer of vancomycin

由图8可见，250 mL三角瓶装液量为25 mL时，万古霉素的发酵水平最高。装液量大于25 mL时，发酵效价迅速降低。因此确定250 mL三角瓶最优的装液量为25 mL。

2.3 50 L发酵罐验证试验结果

按照优化后的培养基配方及发酵条件，接入50 L发酵罐进行验证，连续进罐5批。以第1批进罐效价作为对照，其他批次效价与之比较作为相对效价，结果如表3所示。从表3可以看出，优化后的万古霉素发酵工艺，在较大的发酵罐中保持了良好的适应性和连续性，适合进行工业化生产。

表3 50 L发酵罐验证试验结果Table3 The result of the verification experiment for 50 L-fermentation tank

3 讨论

通过对万古霉素发酵培养基和发酵条件的优化研究，确定发酵培养基的最佳组合为葡萄糖2.0%，淀粉3.0%，豆粕1.8%，大豆粉2.2%，碳酸钙0.2%，氯化钠0.2%。优化后的发酵条件为二级种接种量为10%，装液量为250 mL摇瓶中25 mL。根据优化后的发酵工艺进行50 L罐验证，表明该工艺条件生产效价水平具备良好的连贯性和适应性，适合进行工业化生产。

［1］陈代杰，李继安，邹韵华，等.万古霉素的研究开发［J］.中国抗生素杂志，2004，29(1):8-10.

［2］Ayar-Kayali H，Tarhan L.The correlation between glycogen-glycolysis metabolite pyruvate and vancomycin antibiotie productions of Amycolatopsis orientalis grown in glueose medium［J］.Biochemical Engineering Joumal，2007，33(2):134-140.

［3］Jung H-M，Kim S-Y，Moon H-J.Optimization of culture conditions and scale-up to pilot and plant scales for vancomycin production by Amycolatopsis orientalis［J］.Appl Micorbiol Biotechnol，2007，77(4):787-795.

［4］Voelker F，Altaba S.Nitrogen source governs the patterns of growth and pristinamycin production in Streptomyces pristinaespiralis［J］.Microbiology，2001，147(9):2447-2459.

［5］熊宗贵.发酵工艺原理［M］.北京:中国医药科技出版社，1995:69-70.

［6］肖亦农，徐琼.大豆根瘤菌HH103菌株培养基的筛选与优化［J］.微生物学杂志，2011，31(6):92-95.

［7］夏觅真，蒋颂，罗薇薇，等.土壤放线菌FX05发酵培养基及发酵条件的优化［J］.微生物学杂志，2009，29(4):49-52.

［8］江凌.万古霉素高产菌株的选育研究［D］.天津科技大学，2005:47-48.

［9］J.Clark G，Langley D，E.Bushell M.Oxygen limeitation can induce microbial secondary metabolite foemation:investigatons with miniature electrodes in shaker and bioreactor cultrue［J］.Microbiology，1995，141(3):663-669.