柯 杨，马 瑜，沈莹华，李 勃*

(1.陕西省微生物研究所，陕西西安 710043;2.陕西省农药管理鉴定所，陕西 西安 710003)

植物在生物或非生物因子的影响下，发生一系列形态、生理和生化上的病理变化，使其正常的生长发育被阻碍的现象，称为植物病害。植物病害往往给农业生产带来重大的损失。据不完全统计，目前，全球每年由于昆虫、病原菌以及线虫侵染导致的作物损失接近总产量的三分之一左右，造成巨大的经济损失［1］。长期以来，植物病害的防治主要依赖于化学农药的使用。过去的几十年间，化学农药在农作物种植过程中起到了非常重要的作用，大大提高了农作物产量和品质。然而，大量化学农药在带来这些益处的同时，也造成了严重的问题，如污染土壤和水体、危害生物生存、损害人类健康［2］。因而，各国研究人员一直在探索新的控制作物病害的方法，来降低乃至替代化学农药的使用，来维护食品和环境安全，保护人类健康。存在于土壤中或植物体内的一些微生物，自身对于环境无公害，又兼具控制病害乃至促进植物生长的潜力，自身也可代谢产生具有抑菌效应的物质。因此，开发具有生防作用的微生物农药，成为一种有效的选择。目前，农杆菌属(Agro-bacterium)、芽胞杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)生防菌的应用占了多数［3］，是生防菌应用研究的热点。冬凌草(Rabdosia rubescens)，又名冰凌草，其学名为唇形科香茶菜属植物碎米桠，为多年生草本植物，因其植株在冬季凝结薄如蝉翼、形态各异的蝶状冰凌片而得名，广泛分布于秦岭东南部及太行山区，是我国特有的珍稀药用植物［4］。本研究从秦岭山区的野生冬凌草中筛选到1株内生细菌，就该菌株的分离、筛选和鉴定及其对棉花枯萎病、甘薯干腐病、小麦赤霉病、果树轮纹病等植物真菌病害的防治作用报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物 用于分离拮抗菌的冬凌草(Rabdosia rubescens(Hemsl.)H.Hara)，标本采自河南省三门峡市卢氏县官道口镇(34°14'32″N，111°09'12″E)，海拔746 m的山坡上。

1.1.2 供试病原菌 本实验所用甘薯干腐病(Fusarium oxysproum)、小麦赤霉病(Fusarium graminearum)、棉花枯萎病(Fusarium Wilt)、郁金香种球枯萎病(Fusarium proliferatum)、苹果轮纹病(Macrophoma kuwatsukai)、黑斑病(Alternaria alternate)及稻褐纹病(Nigrospora oryzae)等病原菌，均由本实验室从染病植株中分离获得，现保藏于陕西省微生物菌种资源库(SMRL)。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离、纯化 ①分离方法:参考文献［5］的方法，将所采样品以蒸馏水清洗干净后自然晾干，用无菌处理的打孔器将叶片打孔成直径约0.8 cm的小片，用无菌处理的枝剪将根和茎分别剪切成约0.5～1 cm的小段(两端均需有切口)。采用三步法对组织块进行表面消毒，详细方法如表1所示。消毒处理完毕后，立即将组织块用无菌水漂洗3～4次，取最后一次清洗液500 μL转入无菌培养皿，倒入PDA培养基，于28℃培养3 d，以检测消毒是否彻底;②培养条件:将经过表面消毒的组织块转接于MEA平板上，于28℃培养3～15 d，根据形态及颜色差异挑取不同菌落，纯化后于斜面中保存、备用。

表1 表面消毒方法及处理时间(min)Table1 Procedures and Process times of surface sterilization(min)

1.2.2 拮抗菌的筛选与防效测定 将待筛选菌株斜面培养24 h后，加适量无菌水制备成菌悬液，并将菌悬液稀释到108cfu/mL备用。取200 μL稀释后的菌悬液加入营养琼脂平板，涂布均匀后置于33℃培养24 h，然后在待测菌涂布平板上用6 mm打孔器打取菌片待用。预先取本实验室保存的植物病原真菌，在PDA培养基上活化3～5 d后，用直径5 mm的打孔器在菌落边缘打孔取菌龄一致的菌片，菌丝向下转接到新的PDA平板中央，在距该菌片2.25 cm处的3个点对称接种分离的待测细菌菌片，同时以不接细菌作为对照，每处理3次重复，置于28℃培养3～5 d，测量对照菌落半径及处理菌落半径，计算抑菌率［6］。

1.2.3 拮抗菌的鉴定 ①形态观察及理化测试:参照东秀珠等［7］及Gatson等［8］的方法进行鉴定，并根据伯杰氏手册［9］得到鉴定结果;②细菌基因组DNA提取与PCR扩增:细菌基因组DNA的提取采用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0(宝生物工程有限公司)试剂盒来进行。16S rDNA序列的PCR扩增采用通用引物:Primer F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';Primer R:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGGA-3'。PCR扩增反应条件:95℃ 1 min;95℃ 1min，50℃1.5 min，72℃ 2 min，共35次循环;72℃延伸 4 min，4℃保存。PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，送华大基因科技有限公司进行纯化与序列测定;③分子鉴定及系统发育分析:采用NCBI网站上的Basic BLAST对所测得的DNA序列进行同源性比对，并利用ClustalX 2.0［10］及MEGA 5.0［11］软件采用N-J法构建系统发育树。

1.2.4 拮抗菌内生性检测 参考文献［12-13］的方法，利用利福平标记进行回接测定。将供试菌株转入含0.5 μg/mL利福平的NA平板培养基中，挑取生长的抗利福平突变体菌株，再接入相同利福平浓度的NA培养基中，重复上述步骤，直至筛选到在含有300 μg/mL利福平的NA培养基上能稳定生长、并对病原真菌的拮抗作用不变的KD3突变体菌株。然后采用根部注射和土壤浇灌的方法接种KD3突变体菌株，以不接菌为空白对照，分别于第10天、第20天和第30天选取宿主植物的根、茎及叶片在含300 μg/mL利福平的NA培养基上进行内生细菌分离。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离

2.1.1 表面消毒效果的验证 实验发现，消毒后的组织块最后一次清洗液倒入PDA培养基，经28℃培养3 d后未出现菌落。说明表面消毒效果良好，排除环境及植株表面微生物污染的可能性。

2.1.2 分离结果 根据菌落特征、菌体形态特征及生理生化反应的差异，从根、茎及叶中共分离得到22株不同类型的内生细菌，经初步鉴定分别属于假单胞菌属(Pseudomonas)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、芽胞杆菌属(Bacillus)等6种不同分类单元的内生细菌。

2.2 拮抗菌的筛选与防效测定

2.2.1 筛选结果 采用三点对峙法对所分离到的菌株进行筛选，发现有4株内生菌对于不同病原菌具有一定的抑制作用。其中内生菌KD3具有较广泛的抗菌谱，尤其对镰刀菌属(Fusarium)及大茎点霉属(Macrophoma)的病原菌具有显著拮抗作用。

图1 菌株KD3对病原菌的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of the strain KD3 on pathogenic fungi

2.2.2 防效测定结果 菌株KD3对供试病原真菌抑制作用的结果见表2。

表2 KD3菌株对不同植物病原真菌的抑菌率Table2 Inhibition rate of KD3 to different plant pathogenic fungi

由表2中数据可知，KD3对小麦赤霉病的抑菌率较低，对果树轮纹病的抑菌率最高，对供试病原真菌的抑菌率在50%～80%之间，说明该菌株具有较广的抑菌谱。

2.3 拮抗菌的鉴定

2.3.1 拮抗菌的生理生化鉴定 菌株KD3的革兰染色呈阳性，杆状，单个或成对排列，芽胞中生或近中生，孢子囊无明显膨胀。在营养琼脂上生长时，菌落为近圆形，边缘不规则，表面呈乳白色，直径2～3 mm。该菌株的生理生化鉴定结果如表3所示。

表3 菌株KD3的生理生化鉴定结果Table3 Physiological and biochemical characteristic of KD3

2.3.2 拮抗菌的分子生物学鉴定 菌株KD3的16S rDNA PCR产物长度为1.4 kb左右。该序列已在NCBI注册，注册号为JX993838。利用Basic BLAST将菌株KD3的16S rDNA序列和NCBI中已登录的16S rDNA序列进行同源性比较，对比结果发现菌株KD3与多株枯草芽胞杆菌(B.subtilis)及Bacillus tequilensis的16S rDNA核苷酸序列的同源性均在99.5%以上。利用MEGA5构建的N-J法系统发育树如图2所示。结合生理生化鉴定和同源性比对及系统发育结果，可认定菌株A97为芽胞杆菌属的枯草芽胞杆菌(B.subtilis)。

2.4 菌株KD3的内生性检测

通过利福平标记菌株KD3后，获得1株稳定的突变体。将该突变株重新转接入冬凌草根部后进行再分离实验。由表4结果可见，KD3突变株在接种冬凌草10 d后，在根部及茎部可分离到该突变菌株;到30 d后在叶片中也可分离到该突变株。说明该菌株能够在宿主植物体内有效定殖。

图2 菌株KD3的系统发育树Fig.2 The phylogenetic tree of strain KD3

表4 菌株KD3内生性检测结果Table4 Endophytic test of strain KD3

3 讨论

枯草芽胞杆菌具有多种优良特性，如分布广泛、生长快、抗逆性强、营养要求单一，对环境及人类具非致病性等［14］。此外，该菌亦可在其代谢过程中产生具有抑制植物病原菌效应的脂肽类物质，因而成为现代生物农业技术领域的一个关注热点，是当前研究人员选育生防菌的重要来源之一［15］。目前，国内外已有多种枯草芽胞杆菌生防制剂得到商业化应用。拜耳作物科学公司应用菌株B.subtilisGB03开发的第一个杀真菌剂—Kodiak，其有效成分可控制植物根际病害病原菌Alternaria、Aspergillus、Fusarium及Rhizoctonia，并获准应用于小麦、大豆、大麦、玉米等多种农作物。此后，各公司又开发出的HiStick、Biobest、Greenall G、Larminar及Companion等一系列枯草芽胞杆菌生防制剂，并在美国、欧洲以及亚太地区广泛使用。

本研究从冬凌草组织中分离得到1株对多种植物真菌病害具有较好拮抗作用的细菌KD3，经鉴定该菌株为枯草芽胞杆菌(B.subtilis)。通过三点对峙法的平板实验方法，发现KD3对于多种植物病原菌具有抗性，尤其是针对镰刀菌属的作物土传病害和以轮纹大茎点霉菌为代表的果实采后病害具有比较显著拮抗作用。而且，作为一种植物内生性的芽胞杆菌，KD3能够在植物组织和叶际的微生态环境中迅速定殖生长，而其所产生的芽胞对于紫外线辐射、低温、干燥等环境具有良好的耐受性。这些特性都是理想的采后病害生防菌的必要条件，因而具有良好的开发潜力。下一步将针对其抑菌机理以及该菌株的温室及田间防效进行研究，为开发新的芽胞杆菌生防制剂打下基础。

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