王雪莹，陆舍铭，朱丽，孟昭宇，曹秋娥

（1.红塔烟草集团有限责任公司技术中心，云南玉溪 653100；2.云南大学化学科学与工程学院，云南昆明 650091）

可可碱（3，7 一二甲基黄嘌呤）是黄嘌呤衍生物的一种，属于嘌呤生物碱的化学物质。医药上可可碱具有利尿、心肌兴奋、血管舒张、平滑肌松弛等作用[1]。可可制品作为食品添加剂广泛存在于各种食品和饮料当中，还可作为烟草香料改善烟草吸味[2]。近年来。人们越来越关注食品中的添加剂，而对于香精中的可可碱的检测较少报道，因此，本试验对香精中的可可碱进行检测。

目前，检测嘌呤类生物碱的方法主要有薄层层析-紫外分光光度法[3-4]、液相色谱法[5-9]、气相色谱[10-11]法、离子色谱法[12]等。由于超高效液相色谱法具有灵敏度高、精密度好、分析速度快、重现性好等优点。本文建立了一种测定香精中可可碱的超高效液相色谱法，该法准确、简便快速，能满足香精的实际检验要求，适合批量香精样品的检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈（色谱纯）：美国TEDIA公司；可可碱：中国药品生物制品检定所；水：试验用水均为二次石英蒸馏水，经Millipore 超纯水仪处理，电阻率≥18.2 MΩ·cm，使用前经0.22 μm 水系滤膜过滤；0.22 μm 水系滤膜：福建福州蓝龙过滤器材有限公司；冰乙酸：中国医药集团上海化学试剂有限公司；20 种香精样品：红塔烟草集团提供。

1.2 仪器与设备

ACQUITY UPLCTM 超高效液相色谱仪（Waters 公司），配备真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、恒温柱箱、TUV 检测器和色谱工作站；Millipore 超纯水仪：美国Millipore 公司；PG503-S 电子分析天平（感量0.1 mg）：瑞士Mettler 公司；KQ700DB 型超声清洗仪（江苏省昆山市超声仪器有限公司）。

1.3 色谱分析条件

1.4 样品前处理

准确称取0.50 g（精确0.000 1 g）香精样品，置于50 mL 锥形瓶中，准确加入10 mL 超纯水，于室温下超声萃取40 min。将萃取液经0.22 μm 水系滤膜过滤后移入2 mL 样品瓶，进行超高效液相色谱分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相的选择和洗脱条件的优化

试验中尝试采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-2%乙酸水溶液、乙腈-2%乙酸水溶液作为流动相进行分离分析。试验结果表明采用乙腈-水体系作为流动相时，色谱峰有拖尾，峰形不对称；采用甲醇-水体系结果的色谱峰尖锐，峰面积大，峰宽较窄。甲醇-2%乙酸作为流动相时保留时间短，淋洗效果与甲醇-水相当，故选择甲醇-水作为本试验的流动相。不同流动相的色谱图如图1 所示。

图1 不同流动相洗脱时可可碱标准溶液的UPLC 色谱图Fig.1 UPLC chromatogram of theobromine standard solution in different mobile phase

试验中比较了不同梯度洗脱，分析结果表明：采用梯度洗脱可以使被测组分得到完全分离，梯度不变改变洗脱的流速发现，流速越大，保留时间越短，峰面积越小，峰高越低；流速越小，保留时间越长，峰面积越大，峰宽越宽。梯度洗脱条件为：0 min～10.0 min，1%～5%甲醇；10.0 min～15.0 min，5%～30%甲醇；15.0 min～20.0 min，30%～70%甲醇；20.0 min～28.0 min，70%甲醇；28.0 min～29.0 min，70%～5%甲醇；29.0 min～30.0 min，5%甲醇；试验中优化了淋洗液的流速，比较了流速为0.1、0.15、0.2、0.3 mL/min 的效果。结果表明，在0.10 mL/min的流速下，可可碱的色谱峰尖锐且对称，如图2 所示。

图2 不同流速时可可碱标准样品的UPLC 色谱图Fig.2 UPLC chromatogram of theobromine standard solution in different flow rate

2.1.2 检测波长的选择

由于可可碱的结构特征使其在270 nm 波长附近有紫外吸收。因此，为选择适合可可碱的检测波长，分别在260、265、270、272、274、276、278、280、285、300 nm波长下对样品进行扫描。分析结果显示，在274 nm 波长下可可碱的峰形尖锐（见图4），有最大峰面积（见图3），故选择检测波长为274 nm。

图3 可可碱标准溶液在10 个不同波长下的峰面积比较图Fig.3 Theobromine standard solution peak areas in ten different wavelength

图4 可可碱标准品在4 个不同波长下的UPLC 色谱图Fig.4 UPLC chromatogram of tobromine standard solution in four different wavelength

2.2 萃取剂的选择

准确称取一香精样品0.50 g（精确至0.000 1 g），分别采用10 mL 的超纯水、甲醇、乙腈、体积比为1 ∶1 的甲醇水溶液、乙腈水溶液对该样品进行超声萃取，将萃取液分别经0.22 μm 水系和有机系滤膜过滤后移入2 mL 样品瓶，进行超高效液相色谱分析。分析结果表明：超纯水萃取后样品的色谱峰面积最大（见表1），色谱峰的峰型尖锐且分离完全，因此选取超纯水作为样品分析的萃取剂。

表1 采用不同萃取剂时可可碱的峰面积Table 1 The peak area of theobromine in different extractant

2.3 萃取时间的优化

准确称取一香精样品0.50 g（精确至0.000 1 g），加入10 mL 超纯水，分别超声萃取20、30、40、50、60 min，将萃取液经0.22 μm 水系滤膜过滤后移入2 mL 样品瓶，进行超高效液相色谱分析。分析结果表明：随着萃取时间的不断增加，色谱峰面积先增后缓慢减小，超声萃取40 min 时最色谱峰面积最大，结果如表2 所示，因此选择萃取时间为40 min。

表2 采用不同萃取时间时可可碱的峰面积Table 2 The peak area of theobromine in different extraction time

2.4 工作曲线与检测限

2.4.1 工作曲线的制作

准确称取0.01 g（精确至0.000 1 g）可可碱标准品，使用超纯水并定容至200 mL 容量瓶中，摇匀得到可可碱浓度为50.00 μg/mL 的标准样品储备液。将标准储备液逐级稀释为0.10、1.00、5.00、10.00、25.00 μg/mL 的5 个不同浓度的标准溶液，对标准溶液进行分析检测，得到标准溶液的测定结果，横坐标以保留时间（t）表示，单位为min；纵坐标为峰面积以电导率（AU）表示，单位为μs（见图5）。由测定结果和标准液的浓度可得到标准曲线方程及相关系数（见表3）。

图5 可可碱标准溶液的UPLC 色谱图Fig.5 UPLC chromatogram of theobromine standard solution

2.4.2 检测限

移取标准溶液最低浓度0.10 μg/mL 的标准溶液2 mL 于进样瓶中，平行测定11 次，检测限根据公式CL=K sbl/S[13]计算出仪器检测限。式中，CL－检测限；sbl－测量值标准偏差；S－校正曲线的斜率；K=3；3sbl 对应于90%的置信度。根据测定结果计算出标准偏差并得到可可碱的检测限（见表3）。

表3 可可碱的线性范围、线性方程，相关系数和检测限Table 3 Linear range，linear equation，correlation coefficent and limit of detection of theobromine

2.5 重现性及稳定性

准确称取5 号、19 号香精样品0.50 g（精确至0.000 1 g），平行称取6 份，分别加入10 mL 超纯水，超声萃取40 min，将萃取液经0.22 μm 水系滤膜过滤后移入2 mL 样品瓶，在上述色谱分析条件下进行超高效液相色谱分析，根据分析结果得到相对标准偏差（RSD）见表4，结果显示：一日内重复进样6 次，两种香精样品中可可碱的RSD 分别为0.14%、0.89%，说明该分析方法具有较好的重现性；三日内重复进样6次的RSD 分别为0.22%、1.5%，说明采用本文所述方法检测可可碱时样品在3 d 内具有较好的稳定性。

表4 可可碱的精密度及稳定性Table 4 The repeatability and repeatability of theobromine

2.6 回收率

在19 号香精样品中分别加入高、中、低3 个不同量的可可碱标准样品。准确称取添加标样后的19 号样品0.50 g（精确至0.000 1 g），平行称取3 份，以相同的条件进行萃取和测定，通过未加标测定值、加标量和加标后实际测定值计算其回收率（见表5）。可可碱的回收率在91.86%～93.70%之间，说明回收率较好。

表5 可可碱的回收率Table 5 The recovery of theobromine

2.7 实际样品的测定

准确称取20 种香精样品0.50 g（精确至0.000 1 g）分别在上述萃取和色谱分析条件下进行测定，每个样品平行测定两份，测定结果见表6。

表6 20 种香精样品中可可碱的测定结果Table 6 Theobromine determination result of twenty flavor samples

续表6 20 种香精样品中可可碱的测定结果Continue table 6 Theobromine determination result of twenty flavor samples

3 结论

本试验建立了测定香精中可可碱的超高效液相色谱法，并对20 种不同类型的香精进行了检测。结果表明，可可碱标准品的色谱峰峰型尖锐且对称；在0.16 mg/L～8.00 mg/L 范围内呈良好线性关系（r=0.999 8）；被测定的20 种香精样品中大部分不含有可可碱，5 种被测香精中含有可可碱，含量在34.46 μg/g～249.16 μg/g之间。可可碱相对标准偏差在0.14%～1.58%之间，平均回收率在91.86%～93.70%之间。说明该方法简便快速，稳定可靠，重复性好。

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