杜志强，王建英

（内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010）

凡纳对虾是重要的甲壳类动物，也是目前研究无脊椎动物先天免疫系统的重要模式生物。在无脊椎动物先天免疫系统中，直接发挥抗菌作用的蛋白质分子被称为免疫效应分子；其中，就包括溶菌酶。溶菌酶是一种能够直接破坏细菌细胞壁组分之间的β-1，4-糖苷键的物质，可以使细菌细胞壁发生水解、内容物外泄而死亡[1]。所以，研究清楚溶菌酶基因的免疫机制，有助于更好的开展对虾类细菌、病毒疾病的防治工作。本文以凡纳对虾的溶菌酶基因作为研究对象，克隆该基因的cDNA 序列，并且对基因序列的同源性、分子进化上的亲缘关系、分子的初级结构等进行了分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

凡纳对虾于包头市友谊水产市场购买冷冻保存的冻虾。在实验室待虾体完全溶解之后，采集肝胰腺、鳃等组织，用于提取总RNA。

1.1.2 主要试剂

琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、PCR 产物DNA 回收试剂盒、总RNA 提取试剂盒（TRizol Total RNA Reagent 试剂盒）、cDNA 第一链合成试剂盒、T-载体PCR 产物克隆试剂盒、DEPC、氨苄青霉素钠、DL2000 DNA Marker：购自上海生工生物工程有限公司；其他有机试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 总RNA 的提取

参照使用说明书，利用TRizol 总RNA 提取试剂盒提取凡纳对虾的肝胰腺和鳃等组织的总RNA[2]。检测RNA 的质量后，于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 cDNA 的合成

按照cDNA 第一链合成试剂盒的操作说明[3]，将总RNA 逆转录为cDNA，作为进行目的基因扩增的模板，反转录过程使用的前引物为5′ PCR prime（5′-tacggctgcgagaagacgacagaa-3′），后引物为3′anchor R（5′-gaccacgcgtatcgatgtcgact16（a/c/g）-3′）。

1.2.3 引物设计

根据Genbank 中公布的凡纳对虾溶菌酶基因（Lva-lys）的部分cDNA 序列，设计目的基因特异的克隆引物F（5′-atgagggtgcttcctctggc-3′）和R（5′-aattc gattgttgtaaaaatgg-3′），用来扩增目的基因片段cDNA 的完整开放阅读框（ORF）序列。

1.2.4 目的片段的PCR 扩增

利用前引物F 和反转录使用的后引物3′anchor R引物配对，来扩增目的基因的ORF 的3′端序列；同时利用后引物R 和反转录使用的前引物5′PCR primer引物来扩增目的基因ORF 的5`端序列，以凡纳对虾中提取的各种RNA 反转录成的cDNA 为模板进行PCR 扩增，PCR 条件为[4]：95 ℃3 min、94 ℃30 s、54 ℃30 s、72 ℃30 s、35 个循环；72 ℃后延伸5 min。

1.2.5 重组载体的构建与序列测定

使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测目的基因片段的PCR 扩增结果，利用PCR 产物DNA 回收试剂盒（普通离心柱型）进行回收、纯化；之后，参照T-载体PCR 产物克隆试剂盒的使用说明书，将基因片段克隆到T-载体中，通过热激法将重组子转化到DH5α 宿主菌感受态细胞中[5]；经过蓝白斑筛选之后，将阳性克隆子送往上海生工生物工程有限公司测序部，进行基因片段的序列测定。

1.3 生物信息学分析方法

1.3.1 氨基酸序列比对

将克隆得到的凡纳对虾溶菌酶基因（Lva-lys）cDNA 的ORF 序列输入NCBI 网络数据库，进行相关基因序列比对（http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/）。用Expasy在线软件对这一基因的cDNA 的ORF 序列进行翻译，并对翻译的蛋白质序列进行结构和性质的预测（http：//au.expasy.org）。蛋白质序列信号肽和结构域的预测在SMART（Simple Modular Architecture Research Toll）网站上进（http：//smart.embl-heidelberg.de/）[6]。氨基酸序列比对利用分子生物学软件DNAMAN 完成。

1.3.2 系统进化树的绘制

根据NCBI 网络数据库中进行的凡纳对虾溶菌酶基因（Lva-lys）相关基因序列比对的结果，选择物种相近的一些生物的溶菌酶基因，进行氨基酸序列分析之后，利用分子生物学软件MEGA 4.0 进行系统进化树的绘制。

1.3.3 分子结构的预测

根据Expasy 在线软件对凡纳对虾溶菌酶基因的cDNA 序列进行翻译的结果，利用蛋白质分子初级结构域预测工具SMART 网站进行分子结构的初步预测。

2 结果与分析

2.1 基因克隆和序列分析结果

凡纳对虾溶菌酶基因的cDNA 序列以及演绎的氨基酸序列，见图1。

图1 凡纳对虾溶菌酶基因的cDNA 序列以及演绎的氨基酸序列Fig.1 The cDNA sequence and encoding amino acids sequence of Lva-lys gene

根据序列测定结果，进行序列拼接，得到了凡纳对虾溶菌酶基因cDNA 序列完整的开放阅读框（ORF）。结果显示：Lva-lys 基因的ORF 包括477 bp；演绎出158 个氨基酸。在氨基酸一级结构中，N 末端的18 个氨基酸残基形成信号肽序列（用下划线标注），第19 个至第148 个氨基酸残基形成了一个LYZ1 结构域（用方框标注）。在这个溶菌酶的标志性结构域中，包括8 个保守存在的半胱氨酸残基（用黑色三角形标注），以及组成溶菌酶活性中心的2 个氨基酸残基——Glu51和Asp68（用黑色五角星标注）。这个重要的LYZ1结构域以及结构域里面的8 个保守存在的半胱氨酸残基和2 个重要的活性位点，都是溶菌酶发挥抗菌作用的特殊结构。

2.2 氨基酸序列的同源性分析

凡纳对虾溶菌酶基因与其他物种的溶菌酶基因的氨基酸序列比对结果，见图2。

将克隆得到的凡纳对虾溶菌酶基因（Lva-lys）的cDNA 序列，在NCBI 网上进行基因序列BLAST 比对。从比对结果中，我们选择了核苷酸序列同源性较高的6 种相近物种的溶菌酶基因，进行氨基酸序列的同源性比对分析。我们发现：凡纳对虾的溶菌酶分子（Lva-Lys）与中国明对虾溶菌酶（Fch-Lys）、印度明对虾溶菌酶（Fin-Lys）、南美蓝对虾溶菌酶（Lst-Lys）、日本囊对虾溶菌酶（Mja-Lys）、罗氏沼虾溶菌酶（Mro-Lys）、斑节对虾溶菌酶（Pmo-Lys）在氨基酸序列上具有较高的同源性，相似性达到了92.41%。而且，在这六种溶菌酶分子中，都保守地存在着8 个半胱氨酸残基和两个活性位点Glu51和Asp68。

2.3 系统进化树分析Lva-Lys 与其他溶菌酶分子的亲缘关系

在NCBI 网上进行基因序列BLAST 比对之后，我们选择与凡纳对虾溶菌酶基因的序列同源性较高、而且物种相近的10 种溶菌酶分子，利用分子生物学软件MEGA 4.0 进行系统进化树的绘制，结果如图3。

图3 Lva-Lys 分子与其他溶菌酶分子的进化树分析Fig.3 The phylogenetic tree analysis between Lva-Lys and other lysozyme molecules

在系统进化树上，凡纳对虾的溶菌酶分子（Lva-Lys）与中国明对虾溶菌酶（Fch-Lys）、印度明对虾溶菌酶（Fin-Lys）、罗氏沼虾溶菌酶（Mro-Lys）、斑节对虾溶菌酶（Pmo-Lys）、南美蓝对虾溶菌酶（Lst-Lys）、日本囊对虾溶菌酶（Mja-Lys）分子聚在了一个分支上，而且凡纳对虾的溶菌酶分子（Lva-Lys）与南美蓝对虾溶菌酶分子（Lst-Lys）的亲缘关系最近。

2.4 Lva-lys 分子的结构预测

利用蛋白质分子结构域预测工具SMART 网站，进行凡纳对虾溶菌酶分子的分子结构初步预测，Lva-Lys 分子结构的预测结果，见图4。

图4 Lva-Lys 分子结构的预测结果Fig.4 The prediction result of Lva-Lys molecule structure

分子结构如图4 所示，凡纳对虾溶菌酶分子具有一个经典的溶菌酶分子结构域；根据氨基酸一级结构的特点，我们发现在这个溶菌酶分子的LYZ1 结构域中，在固定的位置保守地存在着8 个半胱氨酸残基，它们可以形成4 对二硫键来稳定这个特殊的结构域。另外，在LYZ1 结构域中，存在着溶菌酶活性中心的2 个活性位点——Glu51和Asp68；正是这2 个活性位点发挥了水解细菌细胞壁β-1，4-糖苷键的功能[7]，而且在不同物种的溶菌酶分子中，它们十分保守。

3 结论与讨论

通过cDNA 序列的克隆，我们获得了凡纳对虾溶菌酶基因完整的开放阅读框，经过核苷酸序列以及氨基酸序列比对，发现溶菌酶分子在不同物种中序列同源性较高；而且，关键的8 个半胱氨酸残基以及2 个活性位点，十分保守地存在着，这也是溶菌酶分子能够广泛地在不同物种中发挥抗菌作用的结构基础。通过对分子结构的研究与分析，我们推测：溶菌酶基因在凡纳对虾的先天免疫系统中应该发挥着重要的抗菌功能。而且，目前所做的这些理论研究工作，将为下一步基因功能的研究提供了重要的理论基础，有助于促进无脊椎动物先天免疫系统的不断完善。

[1]Mai W J,Wang W N.Protection of blue shrimp (Litopenaeus stylirostris) against the White Spot Syndrome Virus (WSSV)when injected with shrimp lysozyme[J].Fish Shellfish Immunol,2010,28(4)：727-733

[2]Du Z Q,Ren Q,Zhao X F,et al.A double WAP domain (DWD)-containing protein with proteinase inhibitory activity in Chinese white shrimp,Fenneropenaeus chinensis[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol,2009,154(2)：203-210

[3]Du Z Q,Li X C,Wang Z H,et al.A single WAP domain (SWD)-containing protein with antipathogenic relevance in red swamp crayfish,Procambarus clarkii[J].Fish Shellfish Immunol,2010,28(1)：134-142

[4]Sun C,Du X J,Xu W T,et al.Molecular cloning and characterization of three crustins from the Chinese white shrimp,Fenneropenaeus chinensis[J].Fish Shellfish Immunol,2010,28(4)：517-524

[5]Jia Y P,Sun Y D,Wang Z H,et al.A single whey acidic protein domain (SWD)-containing peptide from fleshy prawn with antimicrobial and proteinase inhibitory activities[J].Aquaculture,2008,284：246-259

[6]Chen D,He N,Xu X,et al.A double WAP domain-containing protein with antiviral relevance in Marsupenaeus japonicus[J].Fish Shellfish Immunol,2008,25：775-781

[7]Pan C Y,Peng K C,Lin C H,et al.Transgenic expression of tilapia hepcidin 1-5 and shrimp chelonianin in zebrafish and their resistance to bacterial pathogens[J].Fish Shellfish Immunol,2011,31(2)：275-85