赵玉巧，杜云建，王微，赵强

（淮海工学院海洋学院，江苏连云港 222005）

海藻糖是由两个葡萄糖分子组成的一个非还原性双糖[1]，它有3 种异构体，分别是α，α-、α，β-和β，β-海藻糖，天然存在的异构体是α，α 型海藻糖[2]，广泛存在于各种生物体中，包括细菌、酵母、真菌和藻类以及一些昆虫、无脊椎动物和植物中。海藻糖在水中溶解性好且很稳定，在120 ℃加热90 min 无褐变[3]，还可防御如高温、冷冻、脱水和高渗透压等不利环境因素，该特性已被广泛运用于食品、化妆品、医药品等行业[4]，2000 年美国及联合国粮农组织和世界卫生组织均允许海藻糖可无限量加入食品中[5]。

目前海藻糖在我国已有生产，但价格还很高，限制了它的大规模应用。用酵母生产海藻糖的关键技术主要是酵母中海藻糖的产量及简单、高提取率的提取纯化方法。提取海藻糖的方法有水提取法、乙醇提取法、三氯乙酸提取法及微波预处理提取法等，本文以高产量的酒香酵母为材料，系统地研究从酵母中提取海藻糖的方法，以期达到提取方法简单、高效的目的，为酵母提取海藻糖的工业生产打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

由淮海工学院海洋生物活性物质研究实验室从海水中筛选酒香酵母。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 斜面培养基

马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，补煮沸过滤陈海水至1 000 mL，pH 自然。

1.1.2.2 种子及发酵培养基

葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，酵母膏1 g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.2g，补煮沸过滤陈海水至1000mL，pH6.5。

1.1.3 培养条件

种子培养：250 mL 三角瓶装液量为100 mL，培养温度28 ℃，摇床转速为150 r/min，培养时间24 h。

摇瓶培养条件：接种量为8%，培养时间60 h，其余条件与种子培养相同。

湿酵母制备：将发酵液以8 000 r/min 的速度除去上清液，加蒸馏水洗涤2 次，湿酵母放冰箱贮存待用。

1.2 方法

1.2.1 海藻糖的测定方法

硫酸-蒽酮法[6]。

1.2.2 提取率的确定

用三氯乙酸提取5 次测得的海藻糖含量总和作为酵母内海藻糖含量进行计算。

1.2.3 提取方法的研究

1.2.3.1 三氯乙酸提取

在1 g 湿酵母中加10 mL 三氯乙酸溶液（0.5 mol/L）于冰水浴中提取30 min，将提取液以8 000 r/min 的速度离心5 min，取上清液待测。重复上述步骤，共提取10 次。

1.2.3.2 超声波辅助提取

在1 g 湿酵母中加10 mL 蒸馏水，搅拌均匀后用超声波细胞粉碎机处理15 min，在80 ℃水浴提取60 min，离心后菌体再重复上述步骤提取4 次。

1.2.4 乙醇提取条件研究

1.2.4.1 乙醇浓度及加入量选择

在1 g 湿酵母中分别加入乙醇浓度为50%、55%及60%水溶液各6、7、8、9、10 mL，用磁力加热搅拌器搅拌加热回流提取60 min，离心后菌体再重复上述步骤提取1 次，结果为两次提取之和。

1.2.4.2 乙醇提取时间的选择

在1 g 湿酵母中加55%乙醇9 mL，用磁力加热搅拌器分别加热回流提取30、60、90、120 min，离心后菌体再重复上述步骤提取1 次，结果为两次提取之和。

1.2.5 水提取条件研究

1.2.5.1 干、湿酵母的水提取结果研究

在1 g 湿酵母及0.34 g 干酵母（相当于1 g 湿酵母）中分别加10 mL 蒸馏水并搅拌均匀，放入80 ℃的水浴锅中提取60 min。

1.2.5.2 水加入量的选择

在1 g 干酵母中加6、8、10、12、14 mL 蒸馏水并搅拌均匀，放入80 ℃的水浴锅中提取60 min。

1.2.5.3 提取温度的选择

在1 g 干酵母中加12 mL 蒸馏水并搅拌均匀，分别在50、60、70、80、90 ℃的水浴锅水浴提取60 min。

1.2.5.4 提取时间的选择

在1 g 干酵母中加12 mL 蒸馏水并搅拌均匀，在90 ℃水浴锅中分别提取15、30、45、60、75、90 min，离心后菌体再重复上述步骤提取1 次，结果为两次提取之和。

2 结果与分析

2.1 三氯乙酸提取结果

三氯乙酸对酵母中海藻糖提取的影响见图1。

图1 三氯乙酸提取结果Fig.1 Result of trechioroacetic acid extraction

由图1 中可以看出，三氯乙酸提取湿酵母中海藻糖，前三次的提取率分别为83.3%、9.6%、3.3%，前三次提取率总和达到了96.2%。后面7 次的提取总和，仅占海藻糖总量的3.8%。用三氯乙酸提取酵母中海藻糖效果较好，但考虑到三氯乙酸提取杂质多会使精制过程变得繁琐复杂，消耗的成本非常高，另外，废水处理复杂，从三次提取率较高的结果看，该方法用于分析海藻糖时较好。

2.2 超声波辅助提取结果

超声波对酵母中海藻糖辅助提取的结果见图2。

图2 超声波及水提取结果Fig.2 Result of ultrasound and water extraction

从图2 中可以看出，超声波辅助提取湿酵母中海藻糖，第一次的提取率为95.1%，前3 次提取率总和达到了99.1%，提取效果很好，但该方法可使大量大分子物质释放出来，纯化时如果采用膜法去除大分子物质，则可简化纯化步骤降低成本。

2.3 乙醇提取条件研究结果

2.3.1 乙醇浓度及提取液体积对提取率的影响

乙醇浓度及提取液体积对酵母中海藻糖提取的影响见图3。

图3 乙醇浓度级提取液体积对提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration and volume on extraction rate

从图3 可以看出，采用3 种浓度的乙醇溶液提取酵母中海藻糖时，50%乙醇溶液的提取效果最差，而55%的乙醇溶液提取率在所加的提取液体积范围内均最高。另外，随着提取液体积的增多，海藻糖的提取率为逐渐升高的趋势，但至提取液体积为9 mL 时，用55%的乙醇溶液做提取液其提取率升高趋势变缓，考虑到提取液体积越多，分离时设备的体积越大，使设备成本增加，故选择1 g 湿酵母中加入55%的乙醇溶液9 mL 进行提取。

2.3.2 提取时间对提取率的影响

提取时间对酵母中海藻糖提取率的影响见图4。

图4 提取时间对提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate

选择55%乙醇作为提取液，其加入量为9 mL，考察提取时间的影响，试验结果如图4 所示，从图4 可见，提取时间低于60 min 时，提取率较低，高于60 min后提取率上升缓慢，虽然120 min 提取率最高，达到83.6%，但其仅比90 min 高1.7%，考虑到生产效率及产品收率等因素，提取时间以90 min 为宜，由图4 可见，该条件下的两次提取率为81.9%。

2.4 水提取条件研究结果

2.4.1 干、湿酵母的水提取结果

将培养后离心得到的湿酵母与烘干后的干酵母分别进行水提取试验，结果如表1 所示。

表1 干、湿酵母的水提取结果Table 1 Result of water extraction on dry and wet yeast

从表1 中可以看出，干酵母第一次提取的提取率远高于湿酵母，原因可能是烘干后又加水提取的酵母，重新吸水后细胞膜及细胞壁易破裂，使海藻糖易于释放，从干酵母第二次提取率低于湿酵母来看，也与上述推断吻合。由两次提取的结果可见，用干酵母加水提取其效果明显优于湿酵母。

2.4.2 加水量对海藻糖提取的影响

加水量对海藻糖提取结果的影响见图5 所示。

图5 加水量对提取率的影响Fig.5 Effect of water volume on extraction rate

由图5 可见，随着水加入量的增多，一次提取率比总提取率上升趋势快些，原因是提取次数越多菌体中残留的海藻糖越少，使加水量对其影响变小。在加水量超过12 mL 后，无论是一次提取率还是总提取率上升趋势均变缓，可见，加水量太多的话对提取率增加效果不佳，相反，加入太多的水会增加处理量，从而使设备成本增加，因此，选择最佳加水量为12 mL较好。

2.4.3 温度对海藻糖提取的影响

温度对酵母中海藻糖提取的影响见图6。

图6 温度对提取率的影响Fig.6 Effect of temperature on extraction rate

由图6 可见，提取温度高于70 ℃时，提取率较50、60 ℃有显著增加，原因可能是温度超过70 ℃海藻糖的溶解性及分子的扩散性均较好，但提取温度高于70 ℃后，提取率升高趋势变缓，当提取温度为90 ℃时，总提取率可达81.2%，故选择提取温度为90 ℃。

2.4.4 水提取时间对海藻糖提取的影响

水提取时间对酵母中海藻糖提取率的影响见图7。

图7 水提取时间对提取率的影响Fig.7 Effect of water extraction time on extraction rate

由图7 可以看出，随着提取时间的延长，在提取时间为30 min 前，提取率升高很快，但30 min 后上升缓慢，当提取时间为90 min 时，提取率虽最高，但考虑到生产中生产效率必须较高，提取时间不可能无限延长，从图7 中的结果看，提取时间为60、75、90 min时，其两次提取率分别为79.4%、86.6%和88.7%，可见提取时间选择75 min 即可得到较满意的结果。

3 结论

1）用三氯乙酸提取酵母中海藻糖前三次提取率总和达到了96.2%，提取效果较好，但该方法用于工业生产有很多弊端，用于海藻糖的分析较好。

2）超声波辅助提取酵母中海藻糖，一次提取率可达95.1%，三次总提取率为99.1%，其效果很好，但超声波目前还不能处理大批量的物料，仅适用于小批量物料的处理，另外，其提取效果好的主要原因是使酵母细胞破碎海藻糖从细胞中释放出来，但同时也释放出大量的蛋白质、多糖等杂质，若用膜法处理可简化纯化步骤。

3）试验得到乙醇水溶液的最佳提取条件为：1 g湿酵母中加入55%的乙醇溶液9 mL，提取时间90 min，该条件下的两次提取率为81.9%。对水提取采用干酵母比湿酵母提取效果好，得到水提取的最佳条件为：1 g 干酵母中加入12 mL 水，提取温度为90 ℃，提取时间75 min，该条件下的两次提取率为86.6%。比较水提取与乙醇提取的结果，我们可以看出两种方法提取率相差不大。比较提取条件可以看出，水提取的温度高于乙醇水溶液提取，但提取时间比乙醇水溶液短。考虑到乙醇的成本比水的成本高，回收比较麻烦，所以，对工业化大规模生产，选择水提取方法来制备海藻糖比较适宜。

[1]Tarek El-Bashiti,Haluk Hamamci,Huseyin A.oktem,et al.Biochemical analysis of thehalose and its metabolizing enzymes in wheat under abiotic stress conditions[J].Plant science,2005,169：47-54

[2]Attilio Cesaro,Ornela De Giacomo,Fabiana Sussich.Water interplay in trehalose polymorphism[J].Food chemistry,2008,106：1318-1328

[3]任红,杨洋,孙潇.海藻糖的提取方法研究进展[J].中国甜菜糖业,2006(3)：29-31

[4]Youn Jeung Cho,Oh Jin Park,Hyun Jae Shin.Immobilization of thermostable trehalose synthase for the production of trehalose[J].Enzyme and microbial technology,2006,39：108-113

[5]张玉华,凌沛学,籍保平.海藻糖的研究现状及应用前景[J].食品与药品,2005,7(3)：8-13

[6]谭海刚,梅英杰,关凤梅,等.蒽酮—硫酸法测定酵母中海藻糖的含量[J].现代食品科技,2005,22(1)：125-128