刘 猛, 杜 明, 孔莹莹, 张兰威

(哈尔滨工业大学食品科学与工程学院,黑龙江哈尔滨 150090)

乳铁蛋白(lactoferrin,LF)是铁转运蛋白家族中一种铁结合性糖蛋白,主要存在于哺乳动物的各种外分泌物中,如乳汁、泪液或唾液等.LF的分子量约为78 ku[1-2],LF的一级结构是单一的多肽链结构,由约700个氨基酸组成[3].不同种类的乳铁蛋白氨基酸序列具有非常高的同源性,其二级结构以 α-螺旋和 β-折叠结构为主(＞70%),二者沿蛋白质的氨基酸顺序交替排列,且 α-螺旋大大多于β-折叠结构[4],并在二级结构的基础上折叠成两个对称的具有相似结构的球状叶(N-叶和C-叶),中间则由一段螺旋肽链连接,呈“二枚银杏叶型”结构[5-6].人乳中LF含量为2～4 mg/mL,牛乳中含量为 0.01～0.35 mg/mL[7-9],其中牛 LF(bovine lactoferrin,bLF)和人 LF(human lactoferrin,hLF)氨基酸序列同源性达69%,两者在生物活性和理化性质方面均具有较高的相似度.因此,牛乳资源的丰富程度,牛乳乳铁蛋白的相关基础研究备受关注.

热处理是乳制品工业中常见的单元操作,乳铁蛋白受热之后某些生物活性会发生改变甚至消失,这都归因于热处理导致的乳铁蛋白分子空间结构的改变.阐明热处理对于乳铁蛋白结构的影响,对于阐明温度对乳铁蛋白生物活性的影响,进而在产品开发中选择恰当的工艺,或有针对性地进行活性保护等,都具有重要的科学意义和现实意义.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜牛乳,哈尔滨香坊区奶站;牛血清白蛋白,Roche公司;丙烯酰胺,甲叉双丙烯酰胺,Tris,十二烷基硫酸钠,过硫酸铵,TEMED,甘氨酸,溴酚蓝,均购买于美国 Bio-Rad公司;β-巯基乙醇,美国 Sigma公司;考马斯亮蓝G-250,考马斯亮蓝R-250,Amresco公司;SP Sepharose Big Bead,HiLoad 16/60 Su-perdex 200 prep grade,美国 GE公司.

AKTK-100型蛋白纯化仪,美国 GE公司;TGL-16LG型离心机,湖南星科科学仪器有限公司;RLPHR1-4型真空冷冻干燥机,德国Marin Christ公司;164-5050型电泳仪,美国Bio-Rad公司;76S/07421型凝胶成像仪,美国Bio-Rad公司;DK-S26型电热恒温水浴锅,上海精密实验设备有限公司;STA 449C型示差扫描量热仪,德国NETZSCH公司;J-815型圆二色光谱仪,JASCO日本分光公司.

1.2 方法

1.2.1 乳铁蛋白纯化

1.2.1.1 牛乳样品处理

将新鲜牛乳于6 000 r/min离心15 min脱脂.将脱脂乳用1 mol/L乙酸调pH值至4.6,静置30 min后6 000 r/min离心15 min,收集离心后的上清液依次经孔径为0.45μm和0.22μm的滤膜过滤,全部操作在4℃进行.收集流出液以备后续纯化实验.

1.2.1.2 阳离子交换层析纯化

样品首先经强阳离子交换层析 SP Sepharose Big Bead(1.6×50 cm)进行纯化.预先用50 mmol/L pH值为7.1的磷酸盐(PBS)溶液平衡(缓冲溶液A).缓冲溶液B为含有1 mol/L NaCl的缓冲溶液A.采用两段式分步洗脱,先采用含有20%B的混合溶液洗脱400 mL,再用100%B洗脱400 mL,洗脱流速2 mL/min,在280 nm跟踪检测蛋白.依据SDS-PAGE确定LF所在峰.收集目的峰的洗脱液,经过截流分子量为10 ku超滤膜超滤浓缩.

1.2.1.3 体积排阻层析纯化

将1.2.1.2中收集的LF浓缩液经0.22 μm膜过滤并采用Superdex 200(1.6 cm×60 cm)进一步纯化.凝胶柱先用缓冲液20 mmol/L的PBS(pH值为7.6)进行平衡至基线稳定后进行洗脱,流速为0.25 mL/min,280 nm下检测蛋白.采用SDS-PAGE法确定LF所在组分并考查纯化效果,将含有LF的组分采用10 ku超滤膜进行浓缩并真空冷冻干燥.

1.2.2 乳铁蛋白热处理

采用4种热处理参数,分别为63℃处理30 min;72～75℃处理20 s;85℃处理10 min;95℃处理10 min.对乳铁蛋白进行上述不同强度的热处理,然后采用圆二色谱(circular dichroism spectrum,CD)测定样品的α-螺旋和β-折叠的含量(far-UV-CD spectra,波长190～250 nm).

1.2.3 蛋白质浓度测定

采用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度[10].

1.2.4 SDS-PAGE

分离胶采用12%凝胶浓度,浓缩胶采用5%凝胶浓度,在Bio-Rad公司的 Mini-ProteinⅡ型电泳槽进行电泳,浓缩胶时采用80 V电压运行30 min,分离胶时采用100 V电压运行80 min[11].

1.2.5 差示扫描量热法

将纯化后的 LF用0.01 mol/L PBS(pH值为7.6)配制成0.1 g/mL溶液.取10 μL样品溶液置于铝制坩埚中,密封后置于样品舱中,参考盘为空铝盘,保护气体为氮气.设置扫描温度范围为 30～100℃,然后线性升温,升温速率为5℃/min[12-13].进行数据记录和处理得到DSC曲线,峰值点对应的温度为变性温度,曲线形成的峰所包括的面积为蛋白质变性所吸收的热量,确定LF变性温度.

1.2.6 圆二色谱法

圆二色光谱(optical circular dichroism,CD)的测量使用Jasco J-815型圆二色光谱仪,采用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH值为7.6)配制浓度为0.25 mg/mL的LF样品,取0.4 mL经不同热处理的LF溶液于0.1 cm光径的斜口石英比色皿中,将与待测样品溶液相同的体系作为空白,扫描的波长范围190～250 nm,扫描速率50 nm/min,响应时间0.5 s,扫描温度25℃,每隔0.05 nm收集数据[14-15].

1.2.7 统计学及绘图

数据采用Origin 8.0软件进行计算绘图,采用K2D2软件(http:∥www.ogic.ca/projects/k2d2)计算α-螺旋和β-折叠,使用的算法为最小二乘法[16].

2 结果与讨论

2.1 纯化工艺确定

2.1.1 阳离子交换层析纯化

经过强阳离子交换层析SP Sepharose Big Bead得到的蛋白洗脱曲线,见图1.由图1可以看出2个蛋白洗脱峰,分别为用含20%B缓冲溶液和100%B缓冲溶液的洗脱峰,分别收集进行SDS-PAGE确定目的蛋白峰,蛋白电泳图见图2.由图2可以看出峰1中杂蛋白较多,峰2较为纯净,只在小分子量区域有些杂蛋白存在.LF的分子量通常为78 ku[1-2],因此可以判断LF在峰2中,分子量为(78±2)ku左右.将峰2进行超滤浓缩,用于Superdex 200凝胶层析进一步纯化.

2.1.2 Superdex 200凝胶层析纯化

图1 SP Sepharose Big Bead阳离子交换层析Fig.1 Elution of SP Sepharose Big Bead cation exchange column

图2 SP Sepharose Big Bead分离的峰1和峰2电泳图Fig.2 SDS-PAGE of peak1 and peak2 from SP Sepharose Big Bead

图2 中峰2经过Superdex 200凝胶层析得到2个峰,见图3.分别收集进行电泳检测得到如图4和图5,可以看出乳铁蛋白集中在峰2-1,且含有少量杂蛋白,利用凝胶成像仪自带的Quantity One软件测定LF纯度约为94.71%.峰2-2蛋白含量极少,故收集峰2-1超滤浓缩并且真空冷冻干燥.

图3 Superdex 200凝胶层析图Fig.3 Elution of Superdex 200 gel exclusion chromatography

2.2 乳铁蛋白变性温度确定

图4 Superdex 200分离的峰2-1电泳图Fig.4 SDS-PAGE of peak 2-1 from Superdex 200

图5 Superdex 200分离的峰2-2电泳图Fig.5 SDS-PAGE of peak 2-2 from Superdex 200

热处理会使蛋白肽链展开和分子间聚集,使得蛋白结构发生改变,这就将伴随着放热(吸热)过程,并可以通过差式扫描量热方法(differential scan calorimeter,DSC)进行测量.图6是乳铁蛋白的DSC图谱.随着加热温度的升高,在73.1℃,LF出现了一个热焓峰(变性峰),即变性温度为73.1℃.

本研究中,根据LF的DSC图谱及实际生产中的热处理参数,设置加热参数62～65℃加热处理30 min、72℃加热处理10 s、85℃加热处理10 min、95℃加热处理10 min.

2.3 热处理对乳铁蛋白二级结构影响

蛋白质二级结构中α-螺旋和β-折叠结构的含量可以通过CD光谱来估计.圆二色谱紫外区段(190～240 nm),主要生色团是肽链,这一波长范围的CD谱包含了生物大分子主链构象的信息.常在CD谱中200～230 m具有双负峰是α-螺旋结构的反映.α-螺旋构象的CD谱在222,208 nm处呈负峰,在190 nm附近有一正峰.β-折叠构象的CD谱,在210 nm处有一负峰,在195～198 nm处有一强的正峰.

图6 乳铁蛋白的DSC图谱Fig.6 DSC properties of lactoferrin

经不同加热强度处理乳铁蛋白样品的CD图谱如图7.从图7a曲线可以看出,天然状态LF的CD谱在200～230 nm给出双负峰,峰值分别出现在208 nm和222 nm.图7a反映了天然的LF中α-螺旋结构比例较高.随着LF处理温度的升高,双负峰的峰值发生了稍许的红移,222 nm处的第二负峰的峰形变得比较平缓,峰值明显减小,α-螺旋有解旋趋势.这明了α-螺旋构象比例下降,β-折叠构象比例增加.由图7b曲线和图7c曲线可以看出,当温度未到达变形温度时,在一段温度范围内,α-螺旋构象与β-折叠构象比例随着温度变化没有发生明显改变.但当处理温度达到95℃时,双负峰几乎消失,在210 nm处有一个负峰,这是β-折叠构象的反映.

图7 乳铁蛋白的圆二色谱Fig.7 CD properties of lactoferrin

从表1可以看出,随着处理温度的增加,α-螺旋结构的比例逐步减小,β-折叠的比例逐步增加.β-折叠结构比α-螺旋结构更为有序,蛋白质分子排列紧密度增加[17].这说明随着处理温度的增加,α-螺旋构象逐步转变为β-折叠构象,LF蛋白质分子结构的有序性增加,分子排布更加紧密,LF蛋白质分子发生变性趋势明显增加.

表1 乳铁蛋白样品二级结构组分Tab.1 Components of secondary structure of lactoferrin

3 结 论

本研究得到了一种以新鲜牛乳为原料的乳铁蛋白纯化方法.牛乳经过脱脂、除酪蛋白后得到乳清蛋白.然后通过SP Sepharose Big Bead离子交换层析和Superdex 200凝胶过滤层析,超滤浓缩,真空冷冻干燥等方法制备得到 LF,纯度为94.71%.SP Sepharose Big Bead离子交换层析用含0.2 mol/L NaCl和1 mol/L NaCl的PBS缓冲液进行梯度洗脱,流速为2 mL/min.Superdex 200凝胶层析流速为0.25 mL/min,上样量为2 mL,上样浓度为13.6 mg/mL.通过强阳离子交换层析和凝胶层析结合的方法得到电泳纯LF,LF纯度约为94.71%.

通过DSC测得牛乳中乳铁蛋白变性温度为73.1℃.随着热处理温度的增加,乳铁蛋白的二级结构发生变化,α-螺旋结构的比例逐步减小,β-折叠的比例逐步增加,α-螺旋构象逐步转变为β-折叠构象.LF蛋白质分子发生变性趋势明显增加.该研究结果为乳铁蛋白相关产品开发奠定了一定的理论基础.

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