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•论 著•

雷公藤内酯醇对神经胶质瘤U87细胞侵袭性抑制的体外研究

李建斌1翟玉平2祝新根1吕世刚1刘峰1程祖珏1★

目的研究雷公藤内酯醇（triptolide）对体外培养的胶质瘤U87细胞侵袭性的抑制作用，并探讨其作用分子机制。方法使用MTT法检测雷公藤内酯醇对胶质瘤U87细胞增殖抑制作用，Transwell实验检测雷公藤内酯醇处理后细胞侵袭能力的变化，进一步通过Real-Time PCR和Western印迹法检测雷公藤内酯醇对U87胶质瘤细胞的组织蛋白酶 B（Cathepsins B，CB）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）表达的影响。结果雷公藤内酯醇以剂量-效应方式抑制胶质瘤细胞增殖，同时可减弱U87胶质瘤细胞的侵袭能力，下调其CB、MMP-9表达水平。结论在体外实验中雷公藤内酯醇抑制U87胶质瘤细胞侵袭性生长的机制与下调CB及MMP-9的表达，降低胶质瘤细胞水解细胞外基质的能力有关。

雷公藤内酯醇；胶质瘤；侵袭

神经胶质瘤是最主要的颅内恶性肿瘤，约占44.6%[1～2]，其侵袭性生长的特性是神经胶质瘤手术难以全切，预后不良的重要原因。雷公藤内酯醇（triptolide）是从传统中草药雷公藤中提取的二萜类单体，生物学作用广泛，对肺癌、胃癌、白血病、肝癌等多种肿瘤有显著作用[3～6]，可抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡。本研究利用雷公藤内酯醇对神经胶质瘤U87细胞的体外实验研究其在抑制胶质瘤侵袭性生长中的作用及其分子机制，探索神经胶质瘤的有效辅助治疗方法。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

雷公藤内酯醇，纯度＞98%，购自成都曼斯特生物科技有限公司，用二甲基亚砜（DMSO）助溶，10 g/L，–20℃保存，用前用DMEM培养液稀释到终工作浓度（DMSO终浓度＜0.1%）；DMEM培养基、胎牛血清购于全式金公司；P65抗体购自美国Abgent公司；CB和MMP-9抗体为美国Datasheet公司，二抗购自北京中杉金桥生物公司；RNA逆转录试剂盒购自Takara公司。

1.2 细胞系及细胞培养

人神经胶质瘤U87细胞株购自上海中科院细胞库。人神经胶质瘤U87细胞在含有10%胎牛血清DMEM培养基中，置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。每1～2 d换液传代1次，取细胞活性＞98%的对数生长期细胞进行实验。

1.3 MTT法检测细胞增殖

取对数生长期的U87胶质瘤细胞，调整细胞密度为2×104个/mL，每孔200 μL接种于96孔板中，24 h后分为对照组和实验组，每组重复5孔。对照组以培养基作为空白对照，实验组加入雷公藤内酯醇，质量浓度为1，5，25，50，100，200 μg/L，培养24 h后，每孔加人5 g/L的MTT溶液20 uL，37 ℃继续孵育4 h，吸去培养上清液，每孔加入150 uL的DMSO溶液，振荡10 min，使结晶充分溶解后于M450酶标仪测定492 nm波长处的各孔吸光度（A），每个实验重复3次，计算细胞增殖抑制率及IC50值。细胞增殖抑制率=（1-实验组A／对照组A）×100%。

1.4 Transwell体外侵袭实验

将Transwell小室置于灭菌的24孔板中，用80 uL 1∶8稀释的Matrigel胶覆盖小室内膜，室温30 min放置风干，使Mattigel形成凝胶。每孔加入50 uL含10 g/L BSA的无血清培养基水化基底膜，在外室内加入含10% FBS的DMEM培养基。空白对照组和25 μg/L雷公藤内酯醇作用24 h组细胞用无FBS的DMEM培养基重悬，调整细胞密度为1×105个细胞/mL，取200 uL加入内室，重复3组，常规培养48 h。取出小室，弃去培养液，用棉签擦去微孔膜内层细胞，结晶紫染色，倒置显微镜（×250）下计数穿过微孔膜的细胞数。每组细胞随机计数10个视野，求出其平均值，实验重复3次。

1.5 Real-Time PCR检测组织蛋白酶 B（Cathepsins B，CB），基质金属蛋白酶9（MMP-9）基因表达

雷公藤内酯醇处理24 h后，提取各组脑胶质瘤细胞株U87胶质瘤细胞的总RNA，用核酸仪检测RNA浓度及纯度，逆转录成cDNA，Real-Time PCR扩增。Cathepsins B 基因引物序列：上游引物5'-CTGCAGCGCTGGGTGGATCTAGGAT-3'；下游 引 物5'-ACGTTGTAGAAGTTGTGCCCGGC-3'；MMP-9基 因 引 物 序 列： 上 游 引 物（5'-TGTGCTCTTCCCTGGAGACCTGA-3'；下游引物5'-ATGGCCTTCAGCGTGGCGCTAT-3'。内参β-actin引物序列：上游引物5'- TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'；下游引物5'- CGGGAAATCGTGCGTGAC-3'。ABI7300 Real-Time PCR扩增仪两步法扩增，反应条件，变性95 ℃30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s扩增40个循环。结果以2-△△CT值表示，△CT=CT（目的基因）-CT（内参）。

1.6 Western印迹法检测CB， MMP-9表达变化

收集空白对照组及25 μg/L雷公藤内酯醇处理48 h的U87胶质瘤细胞，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后备用。各组去等量蛋白用10% SDS-PAGE凝胶进行电泳、PVDF膜湿转法转膜。5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入P65（1∶1000）、CB（1∶1000）、MMP-9（1∶300）一抗，在4℃下孵育过夜。漂洗过后再加入二抗（1∶5000），于摇床室温孵育1 h。最后与ECL化学发光试剂孵育，曝光、冲洗、显影。

1.7 统计学分析

采用SPSS 16.0软件进行统计分析，比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 雷公藤内酯醇对U87胶质瘤细胞增殖的影响

雷公藤内酯醇作用U87胶质瘤细胞24 h后检测IC50值是25.36 μg/L，不同质量浓度雷公藤内酯醇对U87细胞的抑制率如图1所示，雷公藤内酯醇质量浓度越高，增殖抑制作用越显著，呈剂量-效应关系。

图1 不同质量浓度雷公藤内酯醇对U87细胞的抑制率Figure 1 The concentration-dependent effect of triptolide on the U87 cell viability

2.2 U87细胞体外侵袭力的影响

Transwell体外侵袭实验结果显示，U87胶质瘤细胞组中侵袭入下室的细胞数目为：空白对照组平均102.5±6.5个，雷公藤内酯醇组平均55.4±9.1个，经雷公藤内酯醇作用24 h后U87胶质瘤细胞的侵袭能力较对照组显著下降（P＜0.05）有显著性差异。如图2所示。

图2 雷公藤内酯醇对U87细胞体外侵袭力的影响（×250）Figure 2 Effect of triptolide on cell invasion in U87 cell in vitro

2.3 Real-Time PCR检测U87胶质瘤细胞CB、MMP-9基因表达的影响

雷公藤内酯醇处理24 h后U87胶质瘤细胞的CB，MMP-9基因的mRNA的表达较空白对照组均明显下降。CB基因和MMP-9基因的2-△△CT值分别是0.64 和0.28（P＜0.05），与空白组对比有显著差异。

2.4 雷公藤内酯醇对U87胶质瘤细胞CB、MMP-9的蛋白表达的影响

Western blot法检测发现雷公藤内酯醇对U87胶质瘤细胞作用24 h后与空白对照组相比雷公藤内酯醇组的CB、MMP-9的蛋白相对表达量显著降低，有显著性差异，结果如图3所示。

3 讨论

颅内高度恶性的神经胶质瘤，呈侵袭浸润性生长，手术难以全部切除，早期就可出现脑组织内肿瘤细胞的转移[7]，抑制其侵袭性是改善预后的重要治疗方法。神经胶质瘤的浸润侵袭生长涉及细胞外基质的降解、肿瘤细胞的迁移、肿瘤细胞的黏附等多个过程[8]，抑制相关过程可以降低肿瘤细胞的侵袭能力。

在胶质瘤的侵袭生长过程中组织CB及MMP-9起着十分重要的作用[9～10]，表达水平与肿瘤的预后密切相关。在胶质瘤中CB为高表达，CB的释放使细胞外基质成分降解，促进胶质瘤的侵袭。CB能激活尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）转变为成熟uPA以及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）。MMP-9是MMPs 家族成员，是胶质瘤侵袭过程中发挥着降解细胞外基质和调节肿瘤血管生成的重要作用。CB和MMPs在胶质瘤的侵袭过程中发挥协同作用，能有效降解细胞外基质，促进肿瘤浸润侵袭，其中的MMP-2和MMP-9还与胶质瘤的恶性级别密切相关[11]，抑制MMP-9的表达，能有效降低神经胶质瘤的侵袭性[12]，而高表达MMP-9的胶质瘤细胞侵袭能力明显增强[13]。

图3 雷公藤内酯醇对MMP-9，CB蛋白表达的影响（western blot）Figure 3 The effect of triptolide on MMP-9 and CB protein level

表1 Cathepsins B基因表达水平变化 n=3 （P＜0.05）Table 1 Cathepsins B gene expression level n=3 （P＜0.05）

表2 MMP-9基因表达水平变化 n=3 （P＜0.05）Table 2 MMP-9 gene expression level n=3 （P＜0.05）

本研究结果表明雷公藤内酯醇以剂量-效应方式抑制U87胶质瘤细胞增殖活性。同时通过细胞体外侵袭实验发现，雷公藤内酯醇对U87胶质瘤细胞作用24 h后侵袭能力明显下降，侵入Transwell外室的肿瘤细胞数目较对照组明显减少。结果提示雷公藤内酯醇能降低U87胶质细胞水解细胞外基质能力，使之难以通过微孔膜，从而显著降低其侵袭能力。

本实验PCR结果表明雷公藤内酯醇能显著地降低U87胶质瘤细胞的CB及MMP-9的mRNA表达水平。Western blot结果显示雷公藤内酯醇能明显下调U87胶质瘤细胞诱导的CB蛋白及MMP-9蛋白的表达。因此雷公藤内酯醇可能在转录水平降低CB及MMP-9的mRNA表达，调控CB及MMP-9的转录及合成，从而抑制二者的蛋白合成。雷公藤内酯醇可以通过抑制U87细胞的CB及MMP-9基因的表达从而减弱胶质瘤细胞水解细胞外基质的能力，使胶质瘤的侵袭性降低。

综上所述雷公藤内酯醇对U87胶质瘤细胞的侵袭性生长具有抑制作用，其作用机制可能为通过抑制CB及MMP-9表达，减弱胶质瘤水解细胞外基质的能力，发挥抑制胶质瘤细胞侵袭性生长的重要作用，这为治疗胶质瘤提供了新的思路和实验基础，具体的调控机制有待进一步的研究。

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The anti-invation effect of triptolide for U87 glioma in vitro

LI Jianbin1, ZAI Yuping2, ZHU Xingen1, LV Shigang1, LIU Feng1, CHENG Zhujue1★
(1.Department of Neurosurgery, The Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Jiangxi, Nanchang 330006, China. 2. Department of Neurosurgery, Hukou Hospital, Jiangxi, Jiujiang 332500, China)

Objective To study the anti-invation effect of triptolide for U87 glioma cells and its molecular mechanism. Methods MTT assay was used to determine the growth inhibition by triptolide in glioma U87 cells. Tumor invasion and migration were examined by Transwell Chamber assay. Real-Time PCR and Westerm b1ot was conducted to detect including the alteration of Cathepsins B (CB) and MMP-9. Results

Triptolide could signi fi cantly inhibite glioma U87 cell proliferation, reduce the cell ability of invasion, downregulating MMP-9 and CB expression level. Conclusion Triptolide could depress the invasion of glioma cells owing to down-regulating the expression level of MMP-9 and CB, reduce the ability of hydrolyzing extracellular matrix in vitro.

Triptolide; Glioma; Invasion

江西省教育厅项目（EF130）

1.南昌大学第二附属医院神经外科，江西，南昌 330006 2.湖口县人民医院神经外科，江西，九江332500

★通信作者：程祖珏，E-mail:juejue@126.com