董秋安刘晓伟

•论 著•

恐惧应激大鼠血ACTH、CORT、IL-2、IL-8的含量变化

董秋安1★刘晓伟2

目的探索“恐惧”情绪应激对大鼠内分泌及免疫系统的影响。 方法 根据Takashi方法建立恐惧应激模型，通过放射免疫方法检测ACTH、CORT、IL-2和IL-8，并与正常组、孤独饲养组进行对照。结果各组大鼠ACTH、CORT均有显著差异（F值分别10.466、13.804；均为P＜0.01）。恐惧模型组ACTH、CORT水平高于正常对照组及孤独饲养组。 各组大鼠IL-8比较，存在显著差异（F=3.489，P=0.049），恐惧模型组血清IL-8水平高于正常对照组，各组大鼠IL-2未见显著差异（F=1.355，P=0.280）。结论恐惧可通过激活HPA轴，升高ACTH、CORT水平这一途径调控应激反应。恐惧应激可提高IL-8水平，对机体免疫功能有抑制作用。

恐惧；心理应激；内分泌免疫

近年来，情绪与疾病的关系成为医学领域的研究热点。中医历来重视情志对健康和疾病转归的影响，其“形神合一”、“恐伤肾”等理论，充分体现了中医将自然科学与社会科学、人文科学高度融合的特色，符合生命科学发展的趋势。因此，寻找中医学七情理论与现代心理应激理论的学科交融点，用现代的科学方法探索恐惧心理应激产生的机理，对中医药防治心身疾病及七情学说的研究有着重要的理论价值和临床意义。本实验立足于中医七情学说,参照Takashi[1]方法制作恐惧应激大鼠动物模型，检测恐惧心理应激后大鼠血浆促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）、血清皮质醇（cortisol，CORT）、白介素-2（interleukin-2，IL-2）及白介素-8（interleukin-8，IL-8）的含量，探讨恐惧对内分泌免疫系统的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

雄性Wistar大鼠，体重180～220 g，购自南方医科大学实验动物中心（动物合格证号：粤检证字2002A041号）。室温22～26℃安静环境下饲养。动物分组：正常对照组、恐惧模型组、孤独饲养组，每组8只。

1.2 模型制作方法

恐惧模型组：大鼠单独饲养于不锈钢笼中（50 cm ×30 cm×20 cm），自由饮食饮水，饲养10天。第11天13：30将大鼠单独放入光电刺激仪（30 cm×40 cm ×40 cm），四周为玻璃，底部铺设铜栅，通以1 mA交流电，顶部置10 W日光灯；前5 min为适应期，后同时给予电击和闪光，每次1 s，间隔1 min，共30次。第12，13天重复实验。第14天实验只予光照，不予电击，摄像记录第6 min～30 min内大鼠行为变化。实验结束立即放入旷场实验箱内，进行应激后行为学检测。

孤独饲养组：大鼠于同样环境下孤独饲养10天，第14天13：30摄像记录大鼠行为变化，并对其行为学进行评分，14：00放入旷场实验箱内，进行应激后行为学检测。

同样环境下，正常对照组大鼠予以群居饲养，自由饮食饮水，第14天进行行为学测定及旷场实验，步骤及时间同孤独饲养组。本实验中动物抓取要求动作特别轻柔，避免不必要的刺激干扰实验结果。

1.3 主要试剂

ACTH放射免疫试剂盒、CORT放射免疫试剂盒均购自北京北方生物技术研究所。IL-2、IL-8放射免疫检测试剂盒购自北京北免东雅生物技术研究所。SN695B型放射免疫γ计数器（上海日环厂）、Eppendorff微量加样器（德国Eppendorff公司）、SONY.DCR-TRV9E数码摄像机（日本索尼公司）。

1.4 检测指标及方法

实验第14天，所有动物旷场实验后麻醉，断头处死，取血，部分离心制备血清；部分肝素抗凝离心制备血浆，-20℃冻存。方法按照放射免疫试剂盒说明进行操作，检测血浆ACTH水平、血清CORT 、IL-2、 IL-8含量。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠ACTH、CORT比较

各组大鼠ACTH、CORT均有显著差异（F值分别10.466、13.804；均为P＜0.01）。恐惧模型组血浆ACTH、CORT水平均高于另外两组（均为P＜0.05）；孤独饲养组与正常对照组ACTH、CORT比较，无显著差异（均为P＞0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠ACTH、CORT水平比较Table 1 Comparison of CORT and ACTH of each group

2.2 各组大鼠IL-2、IL-8比较

各 组 大 鼠IL-2未 见 显 著 差 异（F=1.355，P=0.280），各组大鼠IL-8比较，存在显著差异（F=3.489，P=0.049），恐惧模型组血清IL-8水平高于正常对照组（P=0.015）。孤独饲养组IL-8水平与恐惧模型组及正常对照组相较，均无显著差异（均为P＞0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠血清IL-2、IL-8比较Table 2 Comparison of IL-2 and IL-8 in serum of each group

3 讨论

应激反应的主要特征是以下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（hypothalamo-pituitary-adrenal axis，HPA）的激活为核心的生理反应。本实验发现恐惧应激模型组大鼠的下游激素——血浆ACTH、血清CORT均明显高于正常组（均为P＜0.01），表明恐惧心理应激过程中HPA轴被激活，发挥调节作用；心理应激发生时，首先作用于大脑改变脑的内分泌机能，其中最重要的途径是HPA被激活。ACTH和CORT的含量可以反映垂体-肾上腺皮质轴的功能变化[2]。下丘脑为间脑前臂，可以接受末端信息，又能调节交感神经系统和神经内分泌功能，进而控制皮质激素释放激素的分泌，启动HPA轴，影响与应激有关的行为、神经内分泌免疫活动[3]。

HPA轴在内环境的稳定中起着非常重要的作用，应激时HPA轴被激活。ACTH是控制肾上腺皮质激素合成和分泌的重要因素，是垂体分泌的重要激素之一，主要产生于垂体前叶，其合成与分泌对下丘脑-垂体-肾上腺轴的调控具有重要的意义，可反映出HPA轴的功能状态[4]。CORT是肾上腺皮质合成的一种糖皮质激素，是HPA轴的终末产物，体液中的CORT是反映肾上腺皮质功能的重要指标，其分泌依赖于HPA轴的完整性[5]。应激激活HPA轴后，脑垂体前叶分泌ACTH并使肾上腺皮质在几分钟内分泌出皮质醇[6～7]，因此ACTH、CORT常被认为是研究应激的最经典、最重要指标之一。本实验恐惧组和正常对照组ACTH、CORT水平有显著性差异（均为P＜0.01），表明恐惧心理应激过程中，大鼠HPA轴被激活，释放大量ACTH、CORT参与调控应激反应。孤独饲养组与正常对照组ACTH、CORT比较，无显著差异（均为P＞0.05），进一步说明实验造模可以排除孤独饲养的影响。

IL-2主要由活化的T淋巴细胞产生，它能维持T细胞在体外的生长，激活多种免疫细胞，是调节机体免疫功能最主要的细胞因子之一，其水平反映了T细胞的功能状态，因此IL-2分泌水平的高低可作为机体细胞免疫功能的重要指标。另外，IL-2对免疫系统和神经内分泌也具有多方面作用，它可在不同水平上影响下丘脑-垂体-肾上腺轴[8]。本实验各组大鼠IL-2未见显著差异（F=1.355，P=0.280），原因可能和应激时间、方式、强度有关，也可能与恐惧应激影响指标有关，具体关系有待进一步研究。

IL-8是一种小分子量多肽，相对分子质量为8.3×103。IL-8分子含4个Cys，耐热、耐碱，在pH值为2.4～9时保持活性，对巯基化合物敏感，对糜蛋白酶、胰蛋白酶有一定耐受力，其活性可被抗IL-8抗体中和[9]。是一种近年发现的对炎性细胞具有趋化作用的细胞因子，在炎症反应及变态反应中具有重要的调节作用，可引起多种炎性细胞的趋化和活化，其对机体的作用是双向的，小剂量时在防御感染和调节免疫反应方面起重要作用，但过量的IL-8又能诱发炎症反应和组织损伤。IL-8作用于各种免疫活性细胞，主要是趋化和激活中性粒细胞到达炎症部位，释放超氧化物和溶酶体酶、白三烯B4、组胺等多种炎性介质，诱发炎性反应和组织损伤[10]。有研究证实，IL-8是重要的与心理因素相关的免疫因子[11]。本实验中恐惧模型组与正常对照组比较IL-8有显著差异（P=0.015），恐惧模型组血清IL-8水平显著高于正常对照组，提示IL-8参与了恐惧心理应激过程，恐惧应激可提高IL-8水平，对机体免疫功能有抑制作用，恐惧应激对免疫功能的影响还有待进一步研究。

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Effect of fear stress in rats on the contents of ACTH, CORT, IL-2, IL-8

DONG Qiuan1★, LIU Xiaowei2
(1.Department of Traditional Chinese Medicine, Tongji Hospital of Tongji University, Shanghai 200065, China；2.School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China)

Objective To investigate the effects of fear stress on the endocrine and immune systems of rats with fear stress. Methods The fear stress model was established according to Takashis' method. Then, the average contents of ACTH, CORT, IL-2, IL-8 detected by radio immunoassay method were compared in fear group, breed lonely group and normal group. Results There was signi fi cantly difference for the level of ACTH and CORT among three groups (F=10.466, 13.804; P＜0.01). Fear stress could increase the level of ACTH and CORT, compared with other two groups (P＜0.05).There was signi fi cantly difference for the level of IL-8 among three groups (F=3.489; P=0.049) Fear stress could increase the level of IL-8, compared with normal control group (P＜0.05). For the level of IL-2, there was no signi fi cantly difference among three groups (F=1.355，P=0.280). Conclusion Fear could regulate and control the stress response by activating HPA axis and increasing the level of ACTH and CORT. Fear stress could suppress the immune system by increasing the level of IL-8.

Fear stress; Psychological stress; Endocrine-immune

国家自然科学基金（30271567）；广东省中医药管理局基金 （02102074）

1.同济大学附属同济医院中医科，上海，200065

2.南方医科大学中医药学院临床基础教研室，广东，广州 510515

★通讯作者：董秋安，E-mail:zimodong@sina.com