程晓宏，谢 超，史玉坤

醛类、酸类等消毒剂杀菌面广，但毒性强、腐蚀性强。氯类消毒剂作用速度快，性质稳定，但其有效浓度低、易受酸、碱及其他物理、化学因素的影响，且消毒饮用水后的副产物有“三致”效应[1]。银离子消毒剂是一种新型无毒、无味、无刺激、无污染的“绿色杀菌制[1]。银离子还广泛应用作抗菌药物的敷料[2]。目前银离子的检测方法主要有重量分析法、比浊法[3]、原子吸收法[4]、电化学法[5]等。胶体金是氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定纳米尺度的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金具有独特的光学性质：分散状态的胶体金呈红色；聚集状态的胶体金呈蓝色[6-7]。胶体金具有较大的比表面积，能吸附DNA，形成耐受一定浓度盐的胶体金/DNA体系[8]。加入银离子，由于银离子与胞嘧啶C能选择性地结合，形成C-Ag+-C复合物[9]，使得吸附在胶体金表面的DNA和胶体金分离。胶体金在没有DNA大分子的保护下，遇盐会被破坏而聚集变成蓝色[8]。基于此原理，我们建立了简单快速、准确灵敏的胶体金/DNA体系检测银离子的方法。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）试剂：氯金酸（阿拉丁试剂上海有限公司）。柠檬酸钠、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钠（国药集团化学试剂有限公司）。DNA［C20(C)20，C30(C)30，C40(C)40］均购于北京三博远志生物技术有限责任公司。DNA用20 mmol/L pH 7.4磷酸缓冲液（PBS）溶解，90℃恒温水浴加热4 min后，用冰迅速冷却后，4℃低温保存。本实验所用试剂均为分析纯，水为纯净水。胶体金的合成参照Liu的文献[6]：所有玻璃器皿均用王水浸泡处理，纯净水洗涤干净。将1 mL 1%的氯金酸溶液加入100 mL水中，加热至沸腾，剧烈搅拌下快速加入2.5 mL 1%柠檬酸钠（均用0.22 μm孔径滤膜过滤）。在沸腾情况下继续搅拌30 min，离去热源后再搅拌10 min,将金胶溶液置于棕色瓶中4℃低温保存，3个月有效，平均粒径为13 nm。（2）仪器：TU-1905紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器公司），AA240DUO原子吸收分光光度计（美国瓦里安公司），离心机TGL-16G（上海安亭科学仪器厂），恒温水浴锅（上海精宏实验设备公司）。

1.2 方法 取500 μL上述合成的胶体金与50 μL 10 μmol/L DNA涡旋均匀后，室温孵育12 h，每分钟14 000转离心4 min，弃去上清液。加200 μL纯净水涡旋，再加入 400 μL 20 mmol/L pH 7.4 PBS 磷酸缓冲液，涡旋摇匀得胶体金/DNA体系。向体系中加入不同离子孵育，5 min后扫描400～800 nm光谱图，通过比较加入离子前后A660/A530变化大小。

2 结 果

2.1 比较不同尺寸胶体金对吸光度信号变化的影响 胶体金/DNA体系参考Medley文献[10]，太小尺寸和太大尺寸的胶体金，对信号变化贡献较小，中等尺寸胶体金信号变化最大。我们采用较易合成的、中等尺寸的胶体金（13 nm）[6]用于分析。太短长度的DNA C20与胶体金自组装效果不理想，且耐盐效果较差。太长长度DNA C40易形成DNA分子间CAg+-C复合物，反而会增加胶体金间的距离，而使得信号变化较小。免标记的C30被选择用于自组装成的胶体金/DNA体系，且该体系的构建成本大大降低。

2.2 盐对胶体的稳定性有较大影响 较多的盐（如80 mmol/L NaAc）让胶体金/DNA体系不稳定，溶液迅速变蓝。较少的盐（如20 mmol/L NaAc）而使得体系颜色变化不明显。比较40mmol/L NaAc、50mmol/L NaAc、60 mmol/L NaAc不同浓度的盐，对胶体金/DNA体系灵敏度的贡献，发现50 mmol/L NaAc让胶体金/DNA体系相对稳定，故选择用于体系分析，且加入靶分子后体系有较高灵敏度。室温下比较加入银离子前、后A660/A530变化情况，加入银离子5 min后，A660/A530基本能达到稳定。故选择5 min作为体系的检测时间。

2.3 胶体金/DNA体系对银离子的响应情况 对胶体金/DNA体系进行光谱扫描，体系最大波长为530 nm（图1）。当向胶体金/DNA体系中逐渐滴加银离子（0.1～2.0 μg/mL），胶体金/DNA 体系特征波长（530 nm）下的吸收下降较快，表明银离子确实能和C碱基结合。胶体金在没有DNA大分子的保护下，遇盐会被破坏；胶体金/DNA体系会由分散状态的红色变成聚集状态的蓝色。

图1 胶体金/DNA体系对银离子的响应

2.4 工作曲线、检出限、精密度 参考文献[6，8]，采用A660/A530大小来表示Ag+对胶体金/DNA体系的响应情况（图 2）。Ag+与 A660/A530 在 0.1～2.0 μg/mL范围内线性关系较好，线性回归方程为A660/A530=0.1074c+0.3982，相关系数 r=0.999，式中 A660/A530为两波长下吸光度的比值，c为银离子浓度。用3倍空白偏差除以回归方程斜率求得检出限为0.05 μg/mL。平行 7 次测定 1.0 μg/mL Ag+，相对标准偏差RSD为2.8%。

图2 胶体金/DNA体系对银离子的响应情况

2.5 干扰试验 采用 1 μg/mL Ag+，100 μg/mL 对水中 Ca2+、Mg2+、Sr2+、Cu2+、Zn2+、Hg2+、Cd2+、Fe3+、Al3+、Co2+、Ni2+等常见的金属离子进行考察，均未发现明显干扰。

2.6 样品测定 分别准确移取自来水、湖水、废水1 L于大烧杯中，加入新鲜H2O21 mL煮沸约0.5 h，蒸馏后得250 mL自来水、湖水、废水样品。按照试验方法测定处理好的自来水、湖水、废水水样中Ag+的含量，结果见表1。本法与原子吸收光度法（AAS）测定结果基本吻合，并对样品进行加标回收率试验，加标回收率为95.0%～105.6%。经典方法试验与回收率试验验证本法可靠，可应用于水质中银离子的快速检测。

表1 测定6次自来水、湖水、废水中银分析结果（μg/mL，%）

3 讨 论

常用的测银的方法有重量法、比浊法、原子吸收法、电化学法等。重量法、比浊法简便适用性广,是测银最常用的常量分析方法。原子吸收法、电化学法灵敏度高，但需要较强的专业人员操作、复杂的电极制备、电位富集等操作步骤。胶体金/DNA体系检测银离子方法，是基于胶体金独特的光学性质和胞嘧啶C碱基与银离子选择性识别，而建立的简单快速、准确灵敏方法。究其本质它是一种低成本、较高灵敏度的光度分析方法。免标记DNA直接用于使得检测成本降低，增加DNA链上C碱基数，或控制体系盐的浓度来增加测定的灵敏度。目前银离子的卫生标准分析方法中，尚无胶体金/DNA体系法。作为成本低、灵敏度较高、准确度较好的胶体金/DNA体系法对水质中银的测定，有一定的实际意义和参考价值。

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