刘 琼，赵 婧，赵亚红，季亚玮，王亚玲，杨宇民

（南通大学江苏省神经再生重点实验室，江苏226001）

蚕丝主要由外面包裹的丝胶蛋白和内芯的丝素蛋白组成。来自Bombyx mori蚕属的蚕丝尤其具有良好的性能[1-2]，在生物材料方面的应用历史悠久，临床上很早就用于缝合材料[3-4]。丝胶蛋白带有免疫原性，容易引起异体排斥反应[5-7]。顾晓松等将除去丝胶的丝素蛋白制备成神经移植物，并首次用于外周神经的修复取得了良好的效果[8]，且有利于施万细胞的生长，不产生任何毒副作用[9]。PLGA是由乳酸（LA）和羟基乙醇酸（GA）共聚合而成，具有良好的生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性[10-11]等优点,被广泛应用于药物释放，组织工程和骨科手术中。本实验室通过静电纺和编织缠绕的方法，制备出一种新型的静电纺SP-NGCS。但PLGA手术缝线和静电纺丝素蛋白共混之后在体内外的生物相容性如何，是否会对机体产生不良反应？本实验初步对共混的静电纺SP-NGCS体外细胞培养和大白兔皮下植入，对其进行毒性测试和局部组织反应观察。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）丝素溶液：将蚕丝在0.5%的Na2CO3溶液中脱胶，脱胶的丝素蛋白纤维溶解在三元溶剂体系[CaCl2/H2O/EtOH(摩尔比1:8:2]中，透析后铸膜。揭下后的丝素膜用99%的甲酸溶液溶解，形成13%～17%的丝素溶液。（2）静电纺SP-NGCS：将15%的丝素溶液静电纺丝，直径2mm的圆柱轴接收，纺丝一段时间后，取下，编织一层PLGA手术缝线后继续静电纺丝，无水乙醇处理20min，制备成共混的静电纺SP-NGCS。

1.2 方法 （1）浸提液的制备：按照国家生物安全性评价标准，将样品高温高压灭菌后，DMEM培养基浸提，置于37℃的培养箱浸提72±2h。实验组按照制备6cm2/mL浸提液的SP-NGCS，阳性对照组为0.01g/mL 的 β-TCP 浸提液，阴性对照组为 0.01g/mL的有机锡浸提液，分别配制成含有胎牛血清10%，青霉素1×104U/mL和链霉素1×104μg/mL的完全培养基培养施万细胞。（2）施万细胞的原代取材和纯化：取1～3d SD红皮大鼠的背根节和坐骨神经，胰酶消化30min后过筛网种植到培养皿中，阿糖胞苷作用48h后使其增殖，再用Thy1.1抗体和补体作用纯化，纯化后得到纯度为85%以上的施万细胞。（3）施万细胞与浸提液共培养：纯化后的施万细胞按照104个孔种入到96孔板中，分为4组：实验组（SP-NGCS浸提液），阴性对照组（β-TCP浸提液），阳性对照组（有机锡浸提液）和空白对照组。分别用含有SPNGCS，β-TCP和有机锡浸提液的完全培养基和DMEM完全培养基培养施万细胞，观察12h，24h，48h，72h和7d时施万细胞的生长形态。同时采用MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐]法检测细胞活力：在不同的时间点，0.01MPBS轻轻洗涤3遍后，每孔加入100μLMTT（浓度：5mg/mL，溶于 0.01mol/L PBS 中，pH7.2），37℃孵育 4h；吸出反应液后加入10%SDS，37℃孵育24h后利用ELX-800酶标仪490nm处测定吸光度值。并计算相对增殖率 (RGR)：RGR=(实验组均值/阴性对照组均值)×100%，RGR越大，则材料毒性越小。对支架材料的细胞毒性程度进行分级，以阴性对照组的值作为100%的细胞增殖率。RGR≥100%为0级，75%≤RGR≤99%为 1级，50%≤RGR≤74%为 2级，25%≤RGR≤49%为3级，1%≤RGR≤24%为4级，RGR=0为5级。毒性分级：0～1级为合格，2级需结合细胞形态分析综合评价，3～5级为不合格。（4）大白兔皮下植入实验：将本实验自制的SP-NGCS剪成10mm长度，消毒灭菌备用。成年新西兰大白兔5只，皮下植入SP-NGCS，植入后2W,4W,8W,12W,24W取材并拍照，每个时间点取材6个。3%的戊巴比妥钠麻醉大白兔，于背部中心部位备皮（8cm×14cm）,铺上消毒洞巾。在两侧距脊柱周2cm处各做3个5mm长的切口，每个切口间相距4cm，各植入一个10mm长度的SP NGCS，皮肤缝合后75%乙醇消毒，术后常规饲养。各个时间点取材后4%的多聚甲醛固定，10%，20%，30%蔗糖脱水，冰冻切片，HE染色，显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学处理 采用OriginLab OriginPro统计软件包进行数据分析，实验数据以x¯±s表示，采用单因素方差分析进行统计学处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 体外细胞培养 12h后通过显微镜拍照观察，实验组、对照组和阴性对照组细胞呈长梭型，且透光性好，形态均一，胞体饱满。而阳性对照组施万细胞胞体开始收缩成球团。24h后实验组、对照组和阴性对照组的细胞都开始慢慢增殖，细胞数目增多。而阳性对照组施万细胞大片成团，出现悬浮的死细胞，肉眼观察细胞绝大部分都已死亡（图1）。MTT细胞毒性检测结果表明，阳性对照组RGR值在10.9%～19.0%，具有明显的细胞毒性，即有机锡浸提液细胞毒性为4级。然而SP-NGCS浸提液组RGR值在98.6%～103.7%，细胞毒性为 0 级或 1 级，结果表明SP-NGCS无细胞毒性，表现出良好的细胞相容性，符合生物材料细胞毒性实验的安全标准（表1）。

图1 施万细胞培养24h后的生长形态

表1 各实验组不同时间细胞毒性实验结果比较（A值，x¯±s）

2.2 大白兔皮下植入及取材 （1）一般情况：术后所有动物均无明显异常，手术伤口均愈合，且伤口无明显红肿、硬结、感染、出血等不良反应出现。（2）2W，4W，8W，12W，24W肉眼观察，SP-NGCS导管周围未见组织坏死和化脓等现象出现，且随着时间延长、导管形状逐渐变小、最终塌陷，到24W时已大部分降解（图 2）。

图2 大白兔皮下植入后不同时间取材

2.3 组织形态学观察 将各时间点取材的组织切片经HE染色后显微镜下观察，2W导管外围包裹薄层结缔组织，以增生性纤维细胞为主。管腔中见中性粒细胞浸润，出现吞噬材料的巨噬细胞。管腔两端有少量纤维结缔组织长入。4W导管外围包裹的结缔组织略有增厚，以增生性纤维细胞为主。管腔中见中性粒细胞浸润，可见巨噬细胞。管腔两端有少量纤维结缔组织长入。8W导管外围包裹的结缔组织开始变薄，仍以增生性纤维细胞为主。管腔中见中性粒细胞浸润但数量减少，巨噬细胞数量增多；见少量淋巴细胞，管腔两端有较多纤维结缔组织长入。12W导管外围包裹的结缔组织进一步变薄，仍以增生性纤维细胞为主。管腔中仍可见中性粒细胞浸润但数量进一步减少，仍见较多巨噬细胞，淋巴细胞数量增多。管腔两端仍有较多纤维结缔组织长入，管壁变得疏松多处断裂，管腔不完整。24W导管大部分被降解吸收未获得组织切片，各时间点导管周围均未见肉芽肿及组织坏死等不良反应（图3）。

图3 不同时间取材的组织切片HE染色

3 讨 论

作为人工神经移植物必须具备良好的生物相容性，即对细胞没有任何毒性，细胞可正常生长。移植入体内后不会引起任何免疫排斥反应。支架对周围的组织无毒副作用、无致崎性和致突变。反过来周围组织不会对支架产生腐蚀效应和免疫反应，不妨碍神经组织在导管内的生长。最后材料本身可被逐渐降解和吸收，并最终从植入部位消失。

当生物材料移植入机体后，局部组织会对外来异物产生本能的防御性反应。如果植入材料有毒物渗出，炎性反应加剧，严重时会造成组织坏死。如果植入物长期不能降解，就会被淋巴细胞、成纤维细胞和胶原纤维包裹，形成纤维性包膜囊。如果材料稳定没有毒物渗出，在6个月或更长时间内纤维包囊会变薄，囊壁中淋巴组织消失。

根据国家生物安全性标准，分别选用β-TCP为阴性对照组的浸提材料，Sn为阳性对照组的浸提材料，目前已证实β-TCP具有良好的生物相容性，有机锡对细胞有毒害作用。将SP-NGCS制备的浸提液与原代取材的施万细胞共培养，细胞生长状态良好，同时MTT检测结果可看出SP-NGCS浸提液对施万细胞没有毒性作用。同时，SP-NGCS植入大白兔背部皮下局部反应轻，具有良好的生物相容性和生物可降解性。因此共混的静电纺SP-NGCS具有良好的生物相容性，有望于作为理想的人工神经移植物，应用于修复周围神经缺损。

[1]Vepari C,Kaplan DL.Silk as a biomaterial[J].Prog Polym Sci,2007,32(8-9):991-1007.

[2]Zhou J,Cao CB,Ma XL,et al.In vitro and in vivo degradation behavior of aqueous-derived electrospun silk fibroin scaffolds[J].Polymer Degradation and Stability,2010,95(9):1679-1685.

[3]Deveikis JP,Manz HJ,Luessenhop AJ,et al.A clinical and neuropathologic study of silk suture as an embolic agent for brain arteriovenous malformations[J].AJNR Am J Neuroradiol,1994,15(2):263-271.

[4]Durdey P,Bucknall TE.Assessment of sutures for use in colonic surgery:an experimental study[J].J R Soc Med,1984,77(6):472-477.

[5]Wang X,Zhang X,Castellot J,et al.Controlled release from multilayer silk biomaterial coatings to modulate vascular cell responses[J].Biomaterials,2008,29(7):894-903.

[6]Zhu J,Shao H,Hu X.Morphology and structure of electrospun mats from regenerated silk fibroin aqueous solutions with adjusting pH[J].Int J Biol Macromol,2007,41(4):469-474.

[7]Kurioka A,Yamazaki M,Hirano H.Primary structure and possible functions of a trypsin inhibitor of Bombyx mori[J].Biochemistry,1999,259(1-2):120-126.

[8]Yang Y,Ding F,Wu J,et al.Development and evaluation of silk fibroin-based nerve grafts used for peripheral nerve regeneration[J].Biomaterials,2007,28(36):5526-5535.

[9]Yang Y,Chen X,Ding F,et al.Biocompatibility evaluation of silk fibroin with peripheral nerve tissues and cells in vitro[J].Biomaterials,2007,28(9):1643-1652.

[10]Witt C,Mader K,Kissel T.The degradation,swelling and erosion properties of biodegradable implants prepared by extrusion or compression moulding of poly(lactide-coglycolide)and ABA triblock copolymers[J].Biomaterials,2000,21(9):931-938.

[11]Lu L,Peter SJ,Lyman MD,et al.In vitro and in vivo degradation of porous poly(DL-lactic-co-glycolic acid)foams[J].Biomaterials,2000,21(18):1837-1845.