叶亚峻，朱小存，朱治淮，刘 琪，秦 凯

（淮安市肿瘤医院普通外科，江苏223200）

结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率呈明显上升趋势，目前居恶性肿瘤发病率第4位[1]。结肠癌的形成和发展是一个多步骤、多阶段过程,这其中有多种癌基因、抑癌基因、凋亡基因的失活和抗凋亡基因激活及它们的相互促进及拮抗作用。蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）是一种经典非跨膜性蛋白酪氨酸磷酸酶，在信号转导过程中起重要作用，并在许多生理调节过程中也起关键作用。有证据表明PTP1B与多种肿瘤具有相关性，PTP1B在食管癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤和卵巢癌等多种肿瘤发生和发展过程中发挥重要的作用[2-3]。近来Zhu等[4]的研究证实在结肠癌细胞中，PTP1B的过度表达与c-Src中529位点残基的磷酸化抑制能力降低相关，其结果导致软琼脂中集落的快速形成及裸鼠中肿瘤生长加速，最终加速结肠癌细胞的生长。

本研究应用RNAi技术,体外筛选有效靶向人结肠癌LoVo细胞株PTP1B基因的干扰RNA(shRNAPTP1B)建立稳定表达株,分析PTP1B1对结肠癌细胞增殖和成瘤能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)人结肠癌LoVo细胞株（中科院上海生命科学研究院细胞资源中心）。RT-PCR试剂盒（加拿大 Fermentas公司），Trizol，Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司），DMEM培养基，胎牛血清，青霉素、链霉素（美国Gibco公司），兔抗人PTP1B单克隆抗体（美国Abcam公司），Western Blot试剂盒及细胞增殖实验试剂盒(cck-8)（中国碧云天生物技术研究所）。BABL/c裸鼠12只（上海斯莱克实验动物有限公司），4～5周龄，均为雄性。PTP1B引物及内参照引物GAPDH由上海吉凯公司设计并合成，靶向PTP1B的干扰质粒及质粒载体由上海吉玛制药技术有限公司协助设计构建，载体含有编码绿色荧光蛋白(GFP)及新霉素(Neo)的报告基因。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和细胞转染：（1） 人结肠癌LoVo细胞，以含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养基，在37℃含有5%CO2的培养环境中培养。细胞基本铺满瓶底时传代及进行相关操作。（2）细胞转染前1天，将人结肠癌LoVo细胞接种于6孔板，每孔4×105个细胞。加入2mL含10%血清的培养基，放入培养箱中培养过夜，待细胞汇合度在70%～80%时进行转染（LoVo/shRNA）。每孔加入4μg质粒加10μL转染试剂，同时转染空载体作为阴性对照（LoVo/negative），将培养基换成无血清培养基。转染后6h更换培养基。

1.2.2 RT-PCR检测转染前后PTP1B mRNA表达变化：Trizol法提取细胞总RNA，用紫外分光光度计定量，按逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，RT-PCR扩增。PTP1B基因的引物为Forward:5’-CTAAGG-ATCCAAGAAGCAGCAGCGGCTAGG-3Reverse:5’-CAGTGAATTCTGGAGGAGGGTCAGGCTATG-3。GAPDH 基因:5′-CTGCCCAGAACATCATCCCT-3′(forward),3′-TGAAGTCAGGAGACAACC-5′(reverse)。PCR 反应条件为 95°C 2min 预变性，95°C 30s，57.4°C 30s，72°C 30s，共 35 个循环，72°C 10min延伸。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳，发光成像系统拍照，以PTP1B/GAPDH灰度值比值作为PTP1BmRNA的相对表达量。

1.2.3 Western Blot检测转染前后 PTP1B 蛋白及凋亡相关蛋白表达变化:用细胞裂解液提取各组细胞的总蛋白，加热变性后，聚丙烯酰胺凝胶 (SDSPAGE)电泳分离，电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5%脱脂奶粉封闭2h，分别加入兔抗人PTP1B(1∶1 000)一抗，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10min后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶1 000)，室温孵育 2h。化学发光法(ECL)显影。以 βactin作为内参。

1.2.4 用CCK-8试剂盒检测转染前后细胞增殖情况变化：取对数生长期细胞，以每孔5 000个细胞接种于96孔板中培养，每组设置3个复孔。分别于转染后 24h，48h，72h，96h 每孔加入 10μL CCK-8 溶液，放入培养箱中反应2h。用酶联免疫检测仪在450nm处测定每孔吸光值，比较各组细胞的生长情况。

1.2.5 裸鼠成瘤实验：收集各组细胞制备成单细胞悬液，将细胞浓度调整为5×107/mL，按每只裸鼠0.2mL接种于背部靠左上肢的皮下。裸鼠12只分为3组，即转染组、阴性对照组及未转染细胞组(空白对照组)，每组4只。裸鼠饲养于南通大学动物中心SPF屏障环境中，每3天观察1次，记录肿瘤的生长情况及裸鼠的一般状况。接种6周后，取出肿瘤组织，比较各组裸鼠瘤体的大小及重量，绘制肿瘤生长曲线。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，运用Oneway-ANOVA方法对多组间差异进行单因素方差分析的显著性检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 稳定转染细胞株的构建和PTP1B小分子干扰RNA对结肠癌LoVo细胞生长的抑制 使用G418筛选后获得稳定表达LoVo/shRNA和LoVo/negative的LoVo细胞株。RT-PCR结果如图1A所示，LoVo/shRNA组与其他两组比较,PTP1B mRNA含量明显减少 (P＜0.05)，LoVo/negative组与正常对照组比较，差异无统计学意义 (P＞0.05)。同样，Western Blotting结果如图1B所示，PTP1B蛋白表达水平较LoVo/negative组和正常对照组明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图 1 转染后 RT-PCR（A）及 Western Blot（B）检测 PTP1B mRNA及蛋白表达情况

用质粒转染结肠癌 LoVo细胞后，24h、48h、72h、96h分别用CCK-8法检测各组细胞增殖情况如图2所示。转染LoVo/negative细胞和正常对照组细胞相比，24h、48h、72h、96h 时细胞增殖均未受影响 (P＞0.05)。转染LoVo/shRNA细胞与其它两组比较在24h时未受影响，在48h时开始受抑制，72h、96h被明显抑制(P 均＜0.05)。

图2 CCK-8检测结肠癌细胞增殖能力的变化

2.2 PTP1B小分子干扰RNA对结肠癌LoVo细胞裸鼠移植成瘤的影响 LoVo/shRNA细胞，LoVo/negative细胞及未转染细胞分别接种12只裸鼠,全部成瘤,每7天检测肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线如图3A所示：LoVo/shRNA接种组瘤体积明显大于LoVo/negative组和对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而LoVo/negative组和正常对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。7周后将所有裸鼠处死，将所有肿瘤取出称重，结果如图3B所示：肿瘤重量Lo-Vo/shRNA细胞组明显大于LoVo/negative组和对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而 LoVo/negative组和正常对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

图3 各组裸鼠肿瘤生长体积曲线变化（A）及取得的肿瘤组织重量比较（B）

3 讨 论

蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）是蛋白酪氨酸磷酸酶超家族（PTPs）的基本类型之一，是一种经典的非跨膜性PTP。人类PTP1B基因为单拷贝基因，定位于人 20 号染色体 q13.1～13.2，与鼠类 2 号染色体的H2～H3位点同源[5]。PTP1B在多种肿瘤中发挥了重要的作用，多项研究证实PTP1B在不同肿瘤中具有二重性，可以促进也可以抑制肿瘤的发生和发展[2]。Kaminski等[6]研究表明，90% 的乳腺癌同时高表达PTP1B和c-erbB2，在c-erbB2基因缺失的乳腺癌小鼠中，PTP1B缺失可以延迟肿瘤发生。同时发现PTP1B抑制剂对乳腺癌进入潜伏期及对肺转移具有抑制作用，进一步提示PTP1B在乳腺癌发生、发展中具有重要作用[6]。Wiener等[7]采用免疫组织化学法检测卵巢癌组织中PTP1B蛋白的表达，结果显示多数卵巢癌组织中PTP1B过表达，相反在正常卵巢上皮细胞中PTP1B的阳性表达率非常低，甚至不表达。统计学分析结果显示，PTP1B的表达与肿瘤的恶性程度相关。然而Warabi等[8]发现，食管癌细胞中PTP1B mRNA低表达，明显低于正常食管黏膜组织。食管癌中PTP1BmRNA表达量与肿瘤细胞的浸润和转移程度呈负相关，提示PTP1B能够抑制食管癌细胞的转移。

已证实PTP1B在多种肿瘤中发挥重要作用，然而在结肠癌中相关报告鲜见。Zhu等[4]研究证实在结肠癌细胞中，PTP1B过度表达能够促进免疫缺陷小鼠肿瘤生长的加速，从而加速结肠癌细胞的生长。本实验中，通过运用RNA干扰技术构建了针对PTP1B的干扰质粒，转染结肠癌LoVo细胞后，通过G418建立稳定的沉默PTP1B细胞。运用CCK-8检测沉默PTP1B基因后结肠癌细胞增殖能力，并且将稳定转染shRNA-PTP1B的细胞植入裸鼠皮下，检测转染PTP1B后裸鼠成瘤能力变化。结果显示：抑制PTP1B表达后，其细胞体外增殖能力明显降低，体内肿瘤成瘤体积亦明显下降。我们实验既进一步明确PTP1B在结肠癌中的作用，同时也探讨利用RNA干扰靶向目的基因治疗在结肠癌治疗的潜在可能性。

我们认为结肠癌的发生和发展是一个长期多因素分阶段的过程，其中涉及到多种癌基因的突变和抑癌基因的失活。本实验结果表明PTP1B过表达可能与结肠癌的发生和发展有关，但PTP1B的过表达绝不是导致结肠癌发生的唯一因素，必定还有许多其他基因或因素的参与。这些基因或因素是什么，它们之间如何相互作用，这些问题有待进一步的研究。

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[3]孔德姣，石琨.蛋白酪氨酸磷酸酶1B在肿瘤发生和发展中的作用[J].肿瘤，2011，31（12）：1122-1126.

[4]Zhu S,Bjorge JD,Fujita DJ.PTP1B contributes to the oncogenic properties of colon Cancer cells through Src activation[J].Cancer Res,2007,67(21):10129-10137.

[5]Lessard L,Stuible M,Tremblay ML.The two faces of PTP1B in Cancer[J].Biochim Biophys Acta,2010,1804(3):613-619.

[6]Kaminski R,Zagozdzon R,Fu Y,et al.Role of SRC kinases in Neu-induced tumorigenesis:challenging the paradigm using Csk homologous kinase transgenic mice[J].Cancer Res,2006,66(11):5757-5762.

[7]Wiener JR,Hurteau JA,Kerns BJ,et al.Overexpression of the tyrosine phosphatase PTP1B is associated with human ovarian carcinomas[J].Am J Obstet Gynecol,1994,170(4):1177-1183.

[8]Warabi M,Nemoto T,Ohashi K,et al.Expression of protein tyrosine phosphatases and its significance in esophageal Cancer[J].Exp Mol Pathol,2000,68(3):187-195.