李长栋，荔志云，白 海，孙建军，赵 强

颅脑损伤(traumatic brain injury，TBI)是头部受到暴力所造成的损伤，无论在平时或战时，其发生率仅次于四肢伤，但在死亡伤员中占第一位，是死亡率最高的部位伤，一直是战创伤救治的重点和难点。重型颅脑损伤所导致的重度残疾和持续性植物状态的有效治疗也一直是困扰临床医生和科研工作者的难题［1］。

人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs)是一种来源于中胚层具有自我复制更新和多向分化的成体多能干细胞［2］。干细胞移植作为一项治疗TBI新的手段近年来得到人们认同［3］。其可通过多种途径对脑损伤后血脑屏障破坏起着保护和修复受损神经细胞的作用［4］。大黄素甲醚(physcion)为大黄中有效成分之一，文献报道大黄素甲醚具有皮层神经元神经营养作用［5］、抗神经细胞凋亡作用［6］、抗炎性因子和抗氧化作用［7］等。中药对TBI后的神经保护作用已有报道。前期研究表明，大黄素甲醚联合HUCMSCs对脑损伤具有明显保护作用。本研究运用ELISA法，从脑组织微血管基质金属蛋白酶的表达变化方面，动态观察HUC-MSCs移植对脑损伤血脑屏障的保护作用，从其对基质金属蛋白酶变化的影响方面进一步探讨其可能的作用机制。

材料与方法

1 实验动物

Wistat大鼠:体质量200～250g，2～3月龄，雌雄不限;由兰州军区兰州总医院实验动物中心提供。

2 主要仪器和试剂

人脐带间充质干细胞(兰州军区兰州总医院血液病干细胞治疗中心培养);DAPI工作液(美国Sigma公司);低温高速台式离心机(UNIVERSAL116型，德国Hetaeus公司):倒置相差显微镜(CKX41-A32PH型，日本Olympus公司);细胞培养箱(NU-2700E型，德国NUAIR公司);洁净工作台(SW-CJ-2FD型，苏州洁净化设备有限公司);微量移液器(大龙医疗设备上海有限公司):水欲摇床(SBD50-1.610型，Heto公司);恒温循环器(CBN8-30型，Heto公司);－80℃超低温冰箱(MDF-381型，日本三洋有限公司);－20℃冰箱(BCD-218型，兰州长风机器厂):电子天平(AG-135型，瑞士梅特勒公司);流式细胞检测仪(E0675型，美国FACSCALIBUR公司);正置万能显微镜［20050929(ND-11D)，日本Olympus公司］;LG-DMEM基础培养基(购于美国Hyclone公司);胎牛血清(FBS)(购于浙江天杭生物科技有限公司);胰蛋白酶(购于美国Amresco公司);抗体FITC-CD44、PE-CD45、PE-CD34(美国BD公司);大黄素甲醚(陕西信瑞生物科技有限公司，生产批号:SR-20100902);ELISA试剂盒(上海博迈生物科技有限公司)，金属蛋白酶-9及金属蛋白酶组织抑制因子-1(上海博迈生物科技有限公司)。

3 TBI动物模型的建立与实验步骤

将40只大鼠随机分为对照组(10只)、TBI组(10只)、HUC-MSCs移植组(10只)、HUC-MSCs移植+大黄素甲醚组(10只)。对TBI组(10只)、HUC-MSCs移植组(10只)、HUC-MSCs移植+大黄素甲醚组(10只)大鼠进行TBI模型制备，体积分数为10%水合氯醛按3ml/kg体重腹腔麻醉后，采用改良Feeney法建立自由落体撞击造成闭合性颅脑损伤(一根长50cm、直径2.5cm的钢管和重500g的天平砝码)，致伤后大鼠出现四肢抽搐，呼吸暂停数秒，术后昏迷时间2～10h说明致伤成功。HUCMSCs移植组、联合组20只大鼠在制模结束24h后，将HUC-MSCs 2.0×106个细胞悬液0.5ml通过大鼠尾静脉植入。联合组大鼠在移植细胞2～4h开始予大黄素甲醚干预，用药剂量40mg/(kg·d)灌胃，共用药2周。

4 脐带间充质干细胞的培养、鉴定

本实验模仿齐凯等［8］的方法进行脐带间充质干细胞的培养、分离和纯化。取对数期P3代细胞，0.25%胰蛋白酶消化，配制成浓度为10×106/ml的细胞悬液，每个Eppendorf管加100μl的细胞悬液，每种抗体设置2个复管，分别加入20μlFITC-CD44、PE-CD45、PE-CD34，对照管分别加入等量相对应的FITC-IgG1和PE-IgG1，冰上避光孵育30min，PBS洗涤2次，250g离心5min，重新制备细胞悬液，经400目细胞筛过6滤，流式细胞仪(FACSCalibur)上机检测，FACS分析，记数10细胞，CellQuest软件分析结果。

5 取材与处理

对照组和TBI组大鼠在模型制备48h、14d、21d、28d后分批取脑;HUC-MSCs移植组、HUCMSCs移植+大黄素甲醚组大鼠在细胞移植21d断头取脑，将标本分为2份。一份用于HE染色病理学观察(各组自前囟处开始作冠状位切片，隔5取1，至海马结构行苏木精-伊红染色，每个脑标本选取海马相同位置非连续层面5处，每一层面处连续切片3张);一份将脑组织使用匀浆器匀浆后取上清液用于ELISA法检测。

6 统计学处理

结 果

HUC-MSCs流式细胞学检测细胞表面抗原发现，MSC的标志抗原CD45表达阳性，白细胞标志抗原CD44和造血前体细胞标志抗原CD34均表达阴性，证实该细胞为脐带间充质干细胞(图1)。

对照组大鼠脑组织中MMP-9表达较强，模型组较对照组减弱(P＞0.05)。与TBI模型组比较，HUC-MSCs移植组和HUC-MSCs移植组+大黄素甲醚组大鼠脑组织中MMP-9表达减弱(P＜0.01)。对照组大鼠脑组织中TIMP-1表达明显，模型组大鼠脑组织中TIMP-1表达减弱(P＜0.01)。HUC-MSCs移植组和HUC-MSCs移植组+大黄素甲醚组大鼠脑组织中TIMP-1表达均较TBI模型组增强(P＜0.01)，结果见表1。

图1 HUC-MSCs表达CD44，纯度可达99%以上，不表达造血干细胞表型CD34和CD45

表1 各组大鼠脑组织中TIMP-1和MMP-9表达(±s，OD×10－2)

表1 各组大鼠脑组织中TIMP-1和MMP-9表达(±s，OD×10－2)

与对照组比较:△P＜0.01，#P＜0.01;与TBI模型组比较:#P＜0.01;与HUC-MSCs移植组比较:△P＜0.05;TBI组于对照组比较:◆P＞0.05，*P＜0.01

组别 n MMP-9阳性表达TIMP-1阳性表达正常对照组6 36.81±0.04 66.85±0.04 TBI模型组 6 35.81±0.02◆ 42.95±0.05*HUC-MSCs移植组6 22.95±0.02# 47.01±0.05#HUC-MSCs移植组+6 23.53±0.03△ 44.78±0.05△大黄素甲醚组

讨 论

大黄是一味应用广泛的传统中药，主要药理作用包括:致泻、保肝、止血、利尿、抗炎，抑制细胞凋亡等［9－11］。大黄素甲醚(physcion)为大黄中有效成分之一，具有皮层神经元神经营养作用［12］、抗神经细胞凋亡作用［13］、抗炎性因子和抗氧化作用［14］等。TBI后继发性缺血再灌注损伤可引起血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)破坏，导致脑部毛细血管通透性的增加，加重脑水肿［15］。BBB对于维持中枢神经系统内环境的稳定具有非常重要的意义。对于BBB损伤的机制很多，其中原因之一为基质金属酶对毛细血管基底膜的降解［16］。创伤性脑损伤可激活MMP-9降解为细胞外成分，引起BBB的破坏，MMP-9为血管源性水肿和继发性脑损伤的重要因素［17］;TIMP-1是MMP-9的天然特异性抑制剂，在脑损伤中TIMP-1的作用主要是与MMP-9特异性结合，其中TIMP-1可选择性抑制MMP-9，阻断MMP-9对细胞外基质的降解。脑损伤可激活MMP-9，引起MMP-9和TIMP-1失衡，造成血脑屏障破坏［18］。因此，脑损伤后通过调节明胶酶系统失衡可发挥血脑屏障保护作用。其作用机制可能为:(1)通过抑制AQP-4基因转录和翻译，改善血脑屏障损伤减轻脑水肿的作用;(2)增加基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)表达以调节基质金属蛋白酶(MMP-9)平衡，可使脑缺血再灌注损伤大鼠微血管基底膜Ⅳ型胶原(typeⅣcollagen，colⅣ)降解减少，通透性降低，减轻脑水肿，发挥脑保护作用。

本研究显示，TBI后MMP-9表达明显增强，HUC-MSCs移植可明显减弱脑组织MMP-9、增强TIMP-1表达;大黄素甲醚+HUC-MSCs移植组大鼠脑内TIMP-1表达显著增强，认为大黄素甲醚可能是通过上调HUC-MSCs移植后TIMP-1水平以调节基质金属蛋白酶失衡，进而减轻微血管基底膜胶原降解以发挥对血脑屏障保护的促进作用。

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