黄洪武，徐振亮，朱诣琦

(江苏省昆山市公安局，江苏 昆山 215300)

短串联重复序列(short tandem repeat，STR)是广泛存在于人类基因组中的一类具有高度多态性的遗传标记。其核心序列(重复单位)的重复数目存在差异,一般每个位点有近十个到十几个等位基因，以孟德尔共显性方式遗传，在人类基因组中，大约每隔6～10 kb就出现一个STR位点[1]。STR分型具有检测灵敏度高，适宜微量、腐败降解材料鉴定的优点[2]，凭借其操作简单、便于控制及标准化的技术，成为国内外法医学界关注的焦点及第二代法医DNA分型技术的核心[3-4]。随着STR遗传标记的广泛使用，稀有等位基因的出现逐步增多[5-6]，D13S317是位于人类第13号染色体长臂的简单四核苷酸序列重复的STR基因座，其重复单位为TATC，核心重复次数为7～15次。本研究分析了AGCU 17+1 STR荧光检测试剂盒进行STR分型时D13S317基因座检出的“off-ladder”(OL)等位基因，对样品进行了单基因座扩增和测序，并确认该基因座等位基因为稀有等位基因。

1 材料与方法

1.1 血样 DNA数据库建设过程中的个体血样。

1.2 主要试剂及仪器 ABI 3130毛细管测序仪(ABI公司)，PCR仪(博日公司)，凝胶电泳系统(北京六一仪器)，Chelex-100(Bio-rad公司)，AGCU 17+1 STR荧光检测试剂盒(AGCU公司)，LB平板培养基，5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶。

1.3 方法 (1)DNA提取：采用Chelex-100法制备基因组DNA[7]。(2)D13S317位点大片段克隆引物设计：F：5′-GCAGGAAATAGATGGGATCAAA -3′，R：5′-AATCTCCTCCTTCAACTTGGG-3′。(3) PCR扩增：在25 μl反应体系中进行，PCR管反应液含2.5×Reaction Mixture 10 μl。20 μmol/L引物混合物0.3 μl，5 U/μl热启动Taq酶0.25 μl，模板DNA 4.0 μl，ddH2O 10.3 μl，冰上操作。扩增程序：95 ℃预变性11 min，94 ℃变性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后60 ℃延伸60 min，扩增产物于4 ℃保存。(4)PCR产物检测：PCR扩增产物用胶浓度为6%，交联度为5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，垂直型电泳，银染显示电泳谱带。(5)PCR产物TA克隆：PCR扩增产物按Bio-Basic pUCm-T Vector操作手册与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布LB平板培养基(含氨苄青霉素、IPTG、X-Gal)，37 ℃培养14～16 h，筛选白色阳性克隆菌落。(6)目的克隆筛选：将筛选的阳性克隆培养成菌液进行PCR扩增。菌液PCR扩增体系：在20 μl反应体系中进行，PCR管反应液含2.5×Reaction Mixture 8 μl。20 μmol/L引物混合物0.2 μl，5 U/μl热启动Taq酶0.2 μl，模板DNA 2.0 μl，ddH2O 10 μl，冰上操作。扩增程序：95 ℃预变性11 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后60 ℃延伸60 min，扩增产物于4 ℃保存。(7)电泳检测及测序：扩增产物通过ABI 3130遗传分析仪进行毛细管电泳检测，收集电泳信息，得到含目的等位基因的克隆并送上海生工测序。

2 结果

2.1 D13S317基因座“OL”等位基因分型结果 用AGCU 17+1 STR荧光检测试剂盒进行17个STR位点检测，其中D13S317基因座分型结果中出现等位基因11和一个“OL”等位基因，该OL等位基因在Allelic Ladder(7～15)前约4 bp处出现，见图1。

图1 D13S317基因座“OL”等位基因

2.2 D13S317基因座“OL”等位基因测序结果 D13S317基因座定位于人类染色体13q22-q31，核心重复序列为[TATC]，核心重复次数为7～15次，等位基因片段长度大小范围为165～197 bp。AGCU 17+1 STR荧光检测试剂盒中D13S317基因座的Allelic Ladder含有等位基因8～15。测序结果显示：新发现的OL等位基因只含有6个[TATC]重复，是一个新的等位基因。该等位基因不在D13S317基因座常见基因型范围之内，所以标示为OL峰。见图2。

注：方框部分为荧光检测引物结合区；斜体部分为核心重复区图2 D13S317基因座OL等位基因序列比对结果

3 讨论

通常Allelic Ladder包含大部分的常见等位基因片段[8]，而STR分型过程中碰到基因座位于Allelic Ladder范围之外的即OL等位基因，对分型结果的解读产生影响，这类OL等位基因的形成主要有两种类型：一类是出现在Ladder中的两个等位基因之间；另一类是超出Ladder范围[9]。对于OL等位基因的出现，可以通过将扩增产物再次电泳、重新扩增样本或用单基因座引物扩增来确证[10]。本研究利用单基因座引物扩增的方法得到含有一个“正常”等位基因和一个OL等位基因的分型结果。所检测出的OL等位基因在Ladder(7～15)范围之外，小于最小的Allelic Ladder，属于第2种类型。根据样本等位基因的位置与Ladder 中等位基因的大小(bp值)对比得出该OL等位基因在Ladder(7～15)前约4 bp处，大小在161 bp，结合测序技术进行序列分析发现该OL等位基因只含有6个[TATC]重复，推测分型结果中OL等位基因的出现的原因是较低频率的基因，即稀有等位基因的出现。

稀有等位基因是指人群中频率极低的等位基因[11-12]。D13S317基因座位于13号染色体长臂的简单TATC四核苷酸重复，其常见等位基因包含7～15个核心重复序列，也有报道显示存在等位基因5、6、16。研究表明中国人群中D13S317基因座常见等位基因分布为7～14，基因频率分布中等位基因8和11分布处于较高水平[13]，本研究[10]所得出的等位基因为6，在常见等位基因范围之外，属于稀有等位基因。另外，欧阳曙明等[14]对湖南人群D13S317、 D19S433、D21S11[15]、D3S1358、D7S820和FGA等6个基因座的OL等位基因观察与分析，对群体遗传多态性数据进行有效的补充和完善。

PCR检验中常会由于DNA聚合酶发生滑脱，从而导致重复序列中核心序列重复次数的改变而出现突变[16]。本次检出的OL等位基因，经STR-PCR再扩增检测，并经测序获得序列信息，结果具有可重复性，有效地避免了STR-PCR检验中引物结合区变异引起的等位基因丢失进而导致的“假突变”现象，可以确定该稀有等位基因为该个体所特有，是遗传物质遗传过程中染色体畸变或者基因突变的产物[17]。另外STR 基因座在不同群体异质性水平较高，不同人群其等位基因和基因型频率分布有明显的地理差异，尤其是中国人群与美洲人群之间差异特别显著[18-19]。

STR 遗传标记已经在个体识别、亲权鉴定等司法鉴定中发挥着越来越重要的作用，成为全世界法医DNA 实验室运用最广泛的一类遗传标记[20]。

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