田力，田晓晔，于鑫琛，于洋，王瑞新，巴林

(沈阳医学院临床教研室，辽宁 沈阳 110034)

中药的临床运用多以复方的形式出现，遵循君臣佐使的配伍规律，以中医辨证论治为指导原则，具备功效的多向性和适应证的广泛性，能够起到调理、调节、调摄等综合作用，符合现代药物学对多成分药物的认识，复方是中药新药开发的主要对象，其质量标准的研究是中药研究的重要组成部分[1，2]。

抗粘灵气雾剂由白芨、黄芪、赤芍、当归等8味中药材组成，用于预防腹腔术后粘连，效果确切、方法简便易行，为临床外科领域术中抗粘连有效药物。为了保障临床用药安全有效，抗粘灵气雾剂的质量控制显得尤为重要[3-8]。本文首次对抗粘灵气雾剂处方中当归、赤芍等主要药材进行了TLC法鉴别，选择阿魏酸、芍药苷为评价指标，采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)法进行定量测定，比较全面地对抗粘灵气雾剂的质量控制方法进行了研究[9，10]。

1 仪器与材料

Agilent 1100高效液相色谱仪、Agilent1100紫外检测器(美国Agilent公司)；BS110 型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；TG332A型微量分析天平(上海仪器有限公司)；HH-2数显恒温水浴锅(金坛市新航仪器厂)；ZF-1三用紫外线分析仪(上海精科实业有限公司)。

阿魏酸、黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所)；白芨、黄芪、赤芍、当归、灯盏花、大黄(沈阳天益堂大药房)。

甲醇、石油醚、乙醇、环己烷、正丁醇、氯仿(分析纯，天津康科德科技有限公司)；乙酸乙酯、浓硫酸、盐酸、甲酸(分析纯，沈阳化学试剂厂)；冰醋酸(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；香草醛(分析纯，沈阳试剂三厂)；二硝基苯肼(分析纯，上海化学试剂总厂所属试剂三厂)；硅胶G(化学纯，青岛海洋化工有限公司)；羧甲基纤维素钠(沈阳化学试剂厂)。

2 方法与结果

2.1 当归的薄层鉴别

2.1.1 阿魏酸对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，加甲醇制成1.0 mg/ml的溶液，备用。

2.1.2 样品液的制备 按处方比例取当归药材及全方，精密称定，加8倍量85%乙醇，水浴回流2次，每次1.5 h，提取液置蒸发皿中，浓缩至干，取干膏粉末适量，加水1.0 ml，超声振荡使其溶解，制成相当于每1 ml中含1.0 g药材的溶液，离心(10 000 r/min)3 min，取上清液，即得。

2.1.3 阴性液的制备 精密称取除当归外的其他七味药材，按照“2.1.2”项下制备。

2.1.4 薄层色谱条件 薄层板：硅胶G自制板(按《中国药典》2010年版一部附录VIB项下方法制备)；点样：对照品溶液点样2 μl，样品液点样2 μl；展开剂系统：环己烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶3∶0.1)；展开方式：在展开槽中加入展开剂，预平衡15 min后，上行展开；显色：365 nm紫外灯下观察；斑点检视：当归药材，样品液在与阿魏酸相应的位置上出现相同的荧光斑点，而阴性对照液中无相应斑点。

2.2 赤芍的薄层鉴别

2.2.1 芍药苷对照品溶液的制备 取芍药苷对照品适量，加乙醇制成1.0 mg/ml的溶液，备用。

2.2.2 样品液的制备 按处方比例取赤芍药材及全方，精密称定，加8倍量85%乙醇，水浴回流2次，每次1.5 h，提取液置蒸发皿中，浓缩至干，取干膏粉末适量，加水1.0 ml，超声振荡使其溶解，制成相当于每1 ml中含1.0 g药材的溶液，离心(10 000 r/min)3 min，取上清液，即得。

2.2.3 阴性液的制备 精密称取除赤芍外的其他七味药材，按照“2.2.2”项下制备。

2.2.4 薄层色谱条件 薄层板：硅胶G自制板(同“2.1.4”项下)；点样：对照品溶液点样2 μl，样品液点样2 μl；展开剂系统：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(35∶15∶5∶0.5)；展开方式：在展开槽中加入展开剂，预平衡15 min后，上行展开；显色：5%香草醛硫酸溶液；斑点检视：赤芍药材，样品液在与芍药苷相应的位置上出现相同的蓝紫色斑点，而阴性对照液中无相应斑点。

2.3 黄芪的薄层鉴别

2.3.1 黄芪甲苷对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，加乙醇制成1.0 μl/ml的溶液，备用。

2.3.2 样品液的制备 按处方比例取黄芪药材及全方，精密称定，加8倍量85%乙醇，水浴回流2次，每次1.5 h，提取液置蒸发皿中，浓缩至干，取干膏粉末适量，加水1.0 ml，超声振荡使其溶解，制成相当于每1 ml中含1.0 g药材的溶液，离心(10 000 r/min)3 min，取上清液，即得。

2.3.3 阴性液的制备 精密称取除黄芪外的其他七味药材，按照“2.3.2”项下制备。

2.3.4 薄层色谱条件 薄层板：硅胶G自制板(同“2.1.4”项下)；点样：对照品溶液点样2 μl，样品液点样2 μl；展开剂系统：石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(17∶3)；展开方式：在展开槽中加入展开剂，预平衡15 min后，上行展开；显色：2，4-二硝基苯肼乙醇溶液；斑点检视：黄芪药材，样品液在与黄芪甲苷相应的位置上出现相同的橙红色斑点，而阴性对照液中无相应斑点。

2.4 阿魏酸、芍药苷的同时含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：30 ℃；流动相：乙腈-1.4%冰醋酸水溶液线性梯度洗脱，洗脱程序见表1；流速：1.0 ml/min；检测波长：275 nm；进样量：10 μl。

表1 冰醋酸水溶液线性梯度洗脱程序

2.4.2 供试品溶液的制备 按处方比例取白芨、黄芪、赤芍、当归、灯盏花、大黄药材粉末适量，精密称定，加8倍量85%乙醇，水浴回流2次，每次1.5 h，过滤，合并滤液，置于蒸发皿中，低温水浴浓缩至稠膏状，烘箱烘干。干膏用甲醇定容至10 ml，精密量取2 ml样品液于10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度。微孔滤膜过滤，取续滤液在上述色谱条件下进样分析。

2.4.3 色谱系统适用性试验 取供试品溶液，在“2.4.1”色谱条件下进样分析，理论塔板数按阿魏酸峰计算不低于3 000，按芍药苷计算不低于2 000，各色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5。拖尾因子均在0.95～1.05之间。

2.4.4 标准曲线的绘制 分别称取阿魏酸、芍药苷对照品适量，精密称定，分别置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成单组分对照品溶液，其中含阿魏酸0.051 mg/ml、芍药苷0.500 mg/ml。分别精密量取各单组分对照品溶液适量置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液，分别进样10 μl，记录色谱图。以对照品峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。阿魏酸、芍药苷分别在2.04～20.4 μg/ml、32～400 μg/ml范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。所得回归曲线方程阿魏酸y=36.521x-0.0485，r=0.9992；芍药苷y=0.5861x-3.2088，r=0.9993。

2.4.5 重复性 按处方比例精密称取各药材进行提取，共5份，按“2.4.2”项下方法操作，在“2.4.1”色谱条件下测定，阿魏酸、芍药苷含量的相对标准偏差分别为1.5%、1.3%。

2.4.6 仪器精密度 精密吸取混合对照品溶液，按照“2.4.1”项下色谱条件连续进样5次，阿魏酸、芍药苷的RSD分别为0.9%、1.2%。

2.4.7 回收率试验 按处方比例精密称取各药材，共9份，精密加入一定量对照品溶液，按“2.4.2”项下方法操作，在“2.4.1”色谱条件下测定，计算平均回收率。阿魏酸平均回收率为96.2%，RSD为1.5%；芍药苷平均回收率为97.3%，RSD为1.0%。

2.4.8 稳定性试验 取供试品溶液室温下放置，分别于0、2、4、8、12和24 h在“2.4.1”色谱条件下测定。结果表明，阿魏酸、芍药苷均在24 h内稳定，其RSD分别为0.7%、1.9%。

2.4.9 样品测定 按处方比例取各药材粉末共5份，精密称定，同“2.4.2”项下方法操作，在“2.4.1”色谱条件下进样，阿魏酸的平均含量为0.374 mg/g，芍药苷的平均含量为3.752 mg/g。

3 讨论

3.1 TLC的选择 参照《中国药典》2010年版中相关药材的薄层鉴别方法，本研究建立了抗粘灵气雾剂中当归、赤芍、黄芪的薄层鉴别方法。当归的鉴别采用环己烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶3∶ 0.1)为展开剂，在硅胶G板上展开；赤芍的鉴别采用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(35∶15∶5∶0.5)为展开剂，显色剂5%香草醛硫酸溶液，在硅胶G板上展开；黄芪的鉴别采用石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(17∶3)为展开剂，显色剂为2，4-二硝基苯肼乙醇溶液，在硅胶G板上展开。斑点分离较好，结果较为理想。

3.2 HPLC 本研究采用反相HPLC，同时测定了抗粘灵气雾剂中阿魏酸、芍药苷的含量，以乙腈-1.4%冰醋酸水溶液进行线性梯度洗脱，在275 nm波长处进行检测。实验结果表明：阿魏酸在2.04～20.4 μg/ml范围内线性关系良好，相关系数为0.9992，平均回收率为96.2%，RSD为1.5%；芍药苷在32～400 μg/ml范围内线性关系良好，相关系数为0.9993，平均回收率为97.3%，RSD为1.0%。该方法简便、准确、重复性好，为评价抗粘灵气雾剂质量提供了一个定量依据。

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