史　群，林　玮，胡朝军，白伊娜，张　文，张奉春

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 风湿免疫科，北京 100032)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、炎性多关节病并导致进展性的关节损伤和致残。改善病情抗风湿药(disease modified antirheumatic drugs，DMARDs)的应用可阻止RA患者关节炎性反应和骨侵蚀，改善预后。以肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)抑制剂为代表的生物制剂，如依纳西普[1-2]、英夫利西[3-4]和阿达木单抗[5]等属于生物制剂类DMARDs，可有效抑制关节炎性反应、改善预后。

尽管TNF抑制剂疗效显著，但仍有约20%的患者治疗反应不佳[2-3]。由于生物制剂在我国价格昂贵，故寻找可预测治疗有效性及判断疗效的生物标志物对正确合理应用该类药物有重要意义[6]。研究自身免疫性疾病的发病、病情和疗效相关的生物标志物的方法很多，其中蛋白指纹图谱的表达是一种重要手段。关于RA生物治疗的蛋白组学研究国外报道较少[7-9]，而检索中国医院数字图书馆，尚未发现相关文献。本研究通过蛋白指纹图谱筛选英夫利西单抗治疗RA患者前后小分子蛋白的表达情况，为寻找可判断TNF抑制剂有效性的生物标志物提供一定依据。

对象和方法

研究对象

2010年至2011年北京协和医院确诊的RA患者17例，诊断标准符合2010年美国风湿病学会欧洲风湿病学联盟的RA诊断标准[10]；且传统DMARDs治疗效果不佳，按照RA疾病活动评分(disease activity score 28，DAS28)病情为中度和重度活动(DAS28>3.2)。该研究经北京协和医院伦理委员会批准，每例患者均签署知情同意书。

临床疗效评价

疗效指标包括肿胀关节数、触痛关节数、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate， ESR)、C反应蛋白(C reactive protein，CRP)、DAS28、患者健康评估问卷(health assessment questionnaire，HAQ)。疗效判断根据DAS28下降分值，治疗后DAS28下降≥30%者临床判断为有效，DAS28下降<30%者临床判定为无效。

方法

给药方法：治疗第0、2、6、14、22周给予RA患者英夫利西单抗静脉滴注，共5次，每次剂量200 mg。

血清样品：留取患者治疗前、治疗14和26周的外周血标本。所有标本均采用4 ml无抗凝剂的BD真空采血管空腹采血后于4℃静置1 h，4000×g离心5 min。血清分装5管，于―80℃冻存备用。弱阳离子(WCX)纳米磁性微球，购自北京赛尔迪生物技术有限公司。乙腈、三氟乙酸、尿素、Hepes、水(HPLC级)、Tris碱、CHAPS、DTT、Sinapinic acid(SPA)购自Sigma公司。PBSII-C型蛋白质芯片阅读仪为美国赛弗吉公司产品。

标本准备：血清融化后4℃，20 000×g离心10 min。取10 μl血清，加20 μl的U9缓冲液(9 molL尿素、20 gL CHAPS、10 gL DTT、50 mmolL Tris-HCl、pH值9.0)，4℃振摇30 min后加入100 mmolL NaAc 370 μl(pH值4.0)，混匀。

统计学处理

采用Ciphergen ProteinChip软件和BioMarker Wizard软件对蛋白指纹图谱进行统计学处理。治疗前后蛋白质峰的比较采用t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。蛋白质峰值与临床炎性指标相关性采用Pearson相关系数进行分析。

结　　果

英夫利西单抗治疗前后RA患者一般资料及疗效评估

纳入本研究的17例RA患者均为女性，年龄 20～59岁，平均(43±12)岁；病程6～48个月，平均(25±21)月。所有患者治疗前DAS28评分均为中至重度活动。治疗前(第0周)、治疗中(第14周)和治疗后(第26周)主要临床指标见表1。治疗后DAS28下降>30%者13例(76.5%)，临床判断为治疗有效；4例(23.5%)患者DAS28下降<30%，临床判定为疗效不佳。

英夫利西单抗治疗前后患者血清蛋白组学变化

治疗后血清水平下降的小分子蛋白：治疗有效的13例患者治疗后血清蛋白组学检测发现共有10种小分子蛋白的血清水平下降，这10种小分子蛋白分别为mz 8209.4、mz 3303.6、mz 9014.3、mz 8688.2、mz 5851.0、mz 6917.6、mz 4340.5、mz 4514.9、mz 5056.1和mz 10 741.3(表2)。治疗中(第14周)、治疗后(第26周)与治疗前(第0周)蛋白质峰相比，差异有统计学意义(P<0.05)(图1A、C)。上述10种蛋白下降水平与DAS28、ESR和CRP下降呈平行关系，相关性分析具有正相关性。4例疗效不佳者治疗前(第0周)、治疗中(第14周)和治疗后(第26周)上述10种小分子蛋白的表达水平无显著性变化(P>0.05)(图1B、D)。

治疗后血清水平上升的小分子蛋白：经英夫利西单抗治疗后检测血清蛋白水平，发现所有17例患者均有2种小分子蛋白水平上升，分别为mz 5 382.4和mz 5 960.2(图2)，治疗前(第0周)、治疗中(第14周)和治疗后(第26周)上述蛋白表达水平的变化差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表1　英夫利西单抗治疗前后类风湿关节炎患者主要临床指标改变Table 1　Comparison of clinical and laboratory parameters in rheumatoid arthritis patients before and after inflimimab treatment

DAS28：病情活动评分；ESR：红细胞沉降率；CRP：C反应蛋白；HAQ：健康评估问卷；w 0：治疗前(第0周)；w14：治疗中(第14周)；w26：治疗后(第26周)

表2英夫利西单抗治疗后临床改善的RA患者血清水平下降的蛋白质峰

Table2Down-regulated serum protein peaks in RA patients during inflimimab treatment

用药时间m∕z8209 4m∕z3303 6m∕z9014 3m∕z8688 2m∕z5851 0m∕z6917 6m∕z4340 5m∕z4514 9m∕z5056 1m∕z10741 3治疗前(第0周)37 25±25 5318 67±7 8159 51±14 6528 87±14 4514 36±7 6824 29±13 9421 24±5 9720 84±4 967 49±9 383 46±4 08治疗中(第14周)9 81±4 493 99±3 0624 39±13 979 38±7 072 63±2 515 89±4 5211 04±5 1611 76±6 790 57±0 320 20±0 25治疗后(第26周)8 87±5 966 63±5 4222 53±15 529 88±4 034 32±3 317 75±6 9410 59±3 8910 66±4 510 83±0 740 36±0 28P值0 00130 00170 00220 00230 00320 00390 00420 00620 00750 0092

RA：类风湿关节炎

表3英夫利西单抗治疗后RA患者血清水平升高的蛋白质峰

用药时间m∕z5382 4m∕z5960 2治疗前(第0周)2 65±3 083 54±5 18治疗中(第14周)15 21±12 2138 23±30 79治疗后(第26周)14 22±6 8324 78±15 93P值0 00140 0017

RA：类风湿关节炎；mz：质荷比

讨　　论

TNF抑制剂是新型治疗RA的生物制剂，目前已用于治疗传统药物疗效不佳的患者。判断生物制剂疗效的血清学生物标志物除ESR及CRP外，还有致炎性细胞因子水平等。然而，由于此类生物制剂的价格昂贵，在国内较难广泛应用，从药效经济学角度看，如能发现预测生物治疗疗效的生物标志物或将极大程度地减轻患者的经济负担，更有效地选择药物，改善病情和改善预后。因此，寻找能够反映生物制剂疗效的新的生物标志物的研究一直在进行。

研究自身免疫病发病、病情和疗效相关的生物标志物的方法学有许多种，其中蛋白指纹图谱的表达研究是了解自身免疫病的重要突破口。近年来，蛋白组学的研究快速发展，涌现了大量蛋白组学的研究方法并应用于多种临床疾病，风湿免疫病中也有许多相关研究，如关于系统性红斑狼疮、干燥综合征、原发性胆汁性肝硬化等自身免疫病已发现了许多与发病机制相关的生物标志物[11-13]。

图1英夫利西单抗治疗后RA患者血清水平下降的蛋白质指纹图谱

Fig1Expression of down-regulated serum protein in RA patients during Inflimimab treatment by MALDI-TOFMS analysis

RA：类风湿关节炎

图2英夫利西单抗治疗后RA患者血清水平升高的蛋白质指纹图谱

Fig2Expression of up-regulated serum proteins in RA patients during Inflimimab treatment by MALDI-TOFMS analysis

RA：类风湿关节炎

尽管TNF抑制剂治疗RA已被广泛接受，但利用蛋白组学技术发现与TNF抑制剂治疗RA相关的生物标志物的研究并不多。Takeuchi等[8]通过2D胶蛋白组学研究发现，使用英夫利西治疗后，患者血清中下降的蛋白分子包括CRP、血清淀粉样蛋白A、血清淀粉样蛋白P及α-酸糖蛋白，治疗后升高的有视黄素结合蛋白、维生素D结合蛋白以及凝溶胶蛋白。Sekigawa等[9]利用二维液相色谱串联质谱法(2D LC-MS/MS)检测了TNF抑制剂治疗后RA患者血清或血浆中与核转录因子(NF-kB)及关节软骨代谢相关的蛋白水平发生改变。目前尚未发现利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术进行相关研究的文章。

本研究利用MALDI-TOF-MS技术分析经过英夫利西单抗治疗前后RA患者血清蛋白指纹，旨在发现与疗效相关的血清中小分子多肽。本研究发现，治疗有效组患者m/z为8209.4、3303.6、9014.3、8688.2、5851.0、6917.6、4340.5、4514.9、5056.1和10 741.3的蛋白峰在治疗后随病情好转而呈进行性下降，且与DAS28、ESR和CRP水平呈正相关；治疗无效的患者上述小分子蛋白则无上述变化。m/z为5382.5和5960.2的蛋白峰，无论针对治疗有效患者还是无效患者均在治疗后呈进行性上升。根据上述结果笔者推测，治疗后血清水平呈下降及上升的这两类蛋白质分子可能参与了RA的病情进展，治疗前高表达的蛋白促进炎性反应，在治疗后下降；而治疗前低表达的蛋白可能为抑制炎性的因子，治疗后上升。另外，可以根据此结果判断患者对TNF抑制剂的治疗是否有反应，如治疗前上述随治疗而下降的蛋白为低表达，则表明该患者可能而对治疗反应不佳。

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