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比色法检测C1抑制物功能及其在遗传性血管水肿诊断中的应用

2013-04-09支玉香刘宏侠徐迎阳张宏誉

关键词:酯酶敏感性水肿

支玉香,刘宏侠,徐迎阳,张宏誉

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院变态反应科,北京 100730)

C1抑制物(C1 inhibitor,C1 INH)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,其作为一种抑制因子在补体系统、激肽原酶-激肽系统、凝血系统及纤溶系统中发挥作用[1]。C1 INH的含量和(或)功能缺乏会导致以上诸系统的过度活化,尤其在激肽系统中,由于激肽释放酶的过度活化,导致缓激肽水平升高,临床上表现为局限性血管水肿。遗传性血管水肿(Hereditary angioedema,HAE)也属于C1 INH缺乏症,是一种常染色体显性遗传病,发病率为150 000~110 000[2-3]。临床表现为反复发生的皮肤黏膜水肿,肠道水肿时,可引起剧烈腹痛;上呼吸道水肿,可致窒息甚至死亡。由于HAE发病率低,临床上易发生误诊、误治。该疾病的诊断除需要了解家族史和根据典型的临床表现外,主要依赖于实验室对C1 INH功能活性的检测。

近年来,国外较多推荐采用比色法对C1 INH的功能进行检测。北京协和医院变态反应科实验室率先在国内引进了该检测方法,现已建立了我国健康人的正常值范围,并对标本的储存温度和时间对检测结果的影响及其在HAE诊断中的敏感性和特异性进行了评估,现将实验结果报告如下。

对象和方法

对象

受试者为2010年至2012年于北京协和医院变态反应科门诊已明确诊断为HAEⅠ型患者21例,男10例,女11例,平均年龄32.9岁。诊断依据:血管水肿家族史;临床表现为皮肤及黏膜水肿;C1 INH浓度及C4水平均低于正常。健康对照者为2012年北京协和医院体检中心的65名健康体检者,均无水肿史且家族中无血管水肿患者,血尿常规、肝肾功能、心电图及胸X线检查均正常。男35例,女30例,平均年龄33.4岁。

C1 INH功能检测方法及试剂

所有健康对照者和HAE患者均抽取静脉血2 ml,溶于含有0.109 molL的枸橼酸钠抗凝管中(比例为9∶1),立即3 000 rmin离心15 min,用玻璃管收集血浆。按试剂说明书方法进行检测:(1)用缓冲液A将血浆样本及标准品稀释(比例为1∶11)。(2)将底物C1-1与缓冲液B混合(1∶4),37℃预热。(3)取稀释的样本及标准品0.1 ml与0.1 ml的C1酯酶混合,37℃水浴5 min。(4)每份加入底物-缓冲液混合物0.6 ml,37℃水浴3 min。(5)加入50%的乙酸0.2 ml终止反应。(6)波长405 nm,光路10 mm,以空气作空白对照检测吸光度值。(7)C1 INH的活性为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,从标准曲线上读取待检样本的C1 INH的功能活性。C1 INH功能检测试剂盒由奥地利Immno Chrom公司提供,试剂包括底物C1-1(C2H5CO-Lys-Gly-Arg-Pna)、C1 酯酶、标准品及缓冲液A和B。

敏感性和特异性

为了评估该检测方法对HAE诊断的敏感性和特异性,对所有受试者进行C1 INH功能活性检测后,根据HAE患者阳性检测样本占HAE患者总数的百分比计算得出敏感性,根据健康对照者中阴性检测的样本占健康对照者总数的百分比得出特异性。

影响因素分析

为了评估血液标本的储存条件对检测结果的影响,对9名健康对照者进行了研究。每名健康对照者抽取静脉血2 ml,血浆的收集方法与前相同,但将每份血浆分成9组,分别储存于室温(25℃~31℃)3组,4℃ 3组,-20℃ 3组,然后分别于收集血浆后立即、4、8和24 h检测C1 INH的功能活性,对检测结果进行统计分析。

统计学处理

应用SPSS软件对HAE患者和健康对照者的C1INH功能活性检测值的差异及不同储存条件下C1INH的功能活性差异进行统计学分析,以P<0.05为差异有统计学意义。C1 INH功能活性值用(均数±标准差)表示。

结  果

健康对照者正常范围和HAE患者的C1 INH功能检测值

经过3个标准品的检测,绘制出标准曲线(图1)。

65例健康对照者C1 INH功能活性值为(1.07±0.26)U C1 INHml(1U C1 INH相当于1 ml正常新鲜血浆中的C1 INH的功能活性)。因该组数值呈正态分布,因此确立该检测方法的正常值为(1.07±1.96×0.26),即(0.56~1.58)Uml。21例HAE患者的C1 INH功能活性值为(0.11±0.12) U C1 INHml,与健康对照者相比,具有显著差异(P<0.001)(图2)。

图1C1 INH功能活性检测标准曲线

Fig1Functional C1 INH testing standard curve

C1 INH:C1抑制物

敏感性和特异性

65例健康对照者中,所有检测结果均在正常范围;21例HAE患者的C1 INH功能活性均明显低于正常。该检测方法的特异性(65/65)和敏感性(21/21)均为100%。

影响因素

同一组样品保存于室温和4℃中,随着保存时间的延长,C1 INH的功能活性呈逐渐下降趋势,而且保存温度越高,下降趋势越为明显。而保存于-20℃,对检测结果无影响(图3)。

保存24 h时,室温、4℃、-20℃的C1 INH功能活性相比较,差异有显著性(F=5.038,P<0.05);保存4 h和8 h时,室温、4℃、-20℃的C1 INH功能活性相比较,差异均无显著性(F分别为0.787及1.710,均P>0.05)。

讨  论

C1 INH是一种高度糖基化的单链多肽,由478个氨基酸残基组成[4],相对分子质量为105 000,血浆浓度为240 mg/L,相当于1 U/ml,健康人的C1INH半衰期为28 h[5],其底物为C1s、C1r、αFⅫa、βFⅫa、激肽释放酶、FⅪa、纤维蛋白溶酶、MASP-1及MASP-27。因其在多系统中发挥抑制作用,所以C1 INH缺乏会导致多种内源性介质释放,引起局部炎性反应。这些介质来源于激肽原酶-激肽系统和补体系统,而C1 INH对这些系统的活化具有抑制作用,因此认为C1 INH具有抗炎作用[6]。C1 INH浓缩剂已广泛用于HAE急性发作期的治疗及缓解期的预防[7]。

HAE发病的分子机制是C1 INH基因突变导致C1 INH功能缺乏。一方面可能是C1 INH的蛋白含量降低进而导致功能缺陷(HAEⅠ型),约85%的患者属于该类型;另一方面也可能是合成了无功能的C1 INH蛋白(HAEⅡ型),此种情况C1 INH的浓度正常或者轻微升高,但C1 INH的功能低下,约15%的患者属于该类型[8]。可见,无论HAEⅠ型还是Ⅱ型,C1 INH功能检测在HAE诊断中都起着至关重要的作用。

目前商业化的C1INH 功能检测方法有两种,一种是采用比色法检测C1 INH的功能活性。本方法的原理是将血浆标本加入过量的C1酯酶中,形成C1酯酶-C1 INH复合物,然后加入染色底物C1-1(C2H5CO-Lys-Gly-Arg-Pna),与剩余的C1酯酶发生反应,通过检测吸光度得到C1 INH的功能活性。C1-1与C1酯酶具有更高的亲和性,只需要较少的C1酯酶和血浆,即可精确检测C1 INH的功能活性。另一种方法即采用酶联免疫分析法检测C1 INH的功能活性。该方法是先将血浆标本与生物素标记的C1s孵育,形成C1 INH-C1s复合物,然后加入抗人的C1 INH抗体与之反应检测C1 INH的功能活性。

研究表明这两种方法对诊断HAE 均具有较高的敏感性和特异性[9]。目前,比色法的临床应用更为广泛,因其受治疗影响较小,因此更适用于诊断,但对标本的保存温度和时间要求较高[10];而采用酶联免疫分析法易受治疗的影响,因此更常用于监测疗效。本研究对比色法在我国健康对照者中的正常范围及在HAE诊断中的敏感性和特异性进行分析,结果表明该方法对HAE的诊断具有极高的敏感性和特异性,与既往研究结果相似[11]。而且,由于研究者在行敏感性和特异性研究时,不论是健康对照者还是患者标本,均为采集标本后立即检测,因此减少了标本保存温度和时间对结果的影响,使得敏感性和特异性更准确。

为了更加精确地检测C1 INH功能活性,为临床诊断HAE提供更加可靠的依据,本研究就样本的存放温度和时间对C1 INH功能活性的影响进行了评估。结果表明,无论以室温还是4℃保存,如达到24 h,C1 INH的功能活性均明显下降,但保存于-20℃,则无下降;虽然在室温和4℃保存4 h和8 h,与保存-20℃相比差异无显著性,但从结果看,也有不同程度的下降,且保存时间越长,温度越高,下降幅度越大。Ineke等[10]曾对C1 INH功能检测的影响因素进行研究,结果表明健康对照者的样本在室温保存2 h后轻微下降;在-20℃储存长达16 d,C1 INH功能活性依然无变化。有研究对HAE患者血浆和健康人的血浆标本进行了比较,结果表明室温及4℃保存相同时间,HAE患者的C1 INH功能活性下降的更为明显[10,12],表明标本的储存温度和时间对HAE患者C1 INH功能活性的影响远远大于对健康人的影响。

可见,比色法检测C1 INH功能活性对HAE的诊断具有极高的敏感性和特异性,但受标本储存条件的影响较大。因此,建议采血后立即分离血浆进行检测或于-20℃保存24 h或以内检测,否则可能产生假阳性结果。

(本文图2、3见插页第Ⅳ页)

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