陈泽斌，杨跃华，夏振远，雷丽萍，陈海如

1 云南省烟草农业科学研究院，玉溪 653100;2云南农业大学植物保护学院，昆明650201;3 云南省烟草公司玉溪市公司，玉溪 653100

植物体是一个复杂的微生态系统，健康植物体内还有大量的内生细菌，这些内生细菌可促进植物的生长，提高寄主植物的生长势，保持植物良好的生长状态，提高植物自身的抗病能力[1-2]。前人研究还表明，内生细菌可以通过生物固氮[3]活化并促进植物对营养元素如氮磷钾等大量元素和铁等微量元素的吸收[4]，产生多种生理活性物质刺激调节植物生长，如植物激素、酸性物质以及维生素等[5]，提高植物抗旱性、抗盐碱性、抗极端温度和pH值、抗重金属毒害等，提高宿主植物的逆境生存能力[6-7]，对植物病害具有防治作用[6]等。

目前对内生促生菌的筛选和使用主要在水稻苗、棉花、白菜[8-10]上有一些研究，在烟草上尚未见报道。如能从烟草体内筛选出对烟草生长有促进作用的有益菌，可为内生促生菌的促生长作用原理的研究提供技术基础。鉴于云南生态多样性，生物多样性，微生物种类多，烟草种植面积大的特点。笔者对云南省主栽烟草品种大量采样，从烟草的不同组织中分离出多种内生细菌，从中筛选出了对烟草有促生作用的菌株，并对其在烟草漂浮育苗中的应用效果进行了初步研究，以期将促生效果最佳的菌株应用于烟叶生产中。

1 材料和方法

1.1 供试菌株和烟草品种

烤烟品种K326裸种由云南省烟草农业科学研究院提供；烟草内生细菌为2010年采用平板稀释法从云南省不同烟区、不同烟草品种、不同生长期的叶及成熟期的根、茎分离获得[11]。

1.2 培养基、主要试剂及仪器

内生细菌的活化用NA[12]、液体培养用LB[12]。内生细菌DNA提取、16S rDNA片段扩增、Marker、dNTPs、Buffer等试剂为宝生物工程产品。

1.3 内生促生细菌的筛选

1.3.1 培养皿发芽试验初筛

斜面保存的菌种在NA平板上活化后接种到LB培养液中，于28℃，200 r/min的摇床中培养48 h后，制成108cfu/mL浓度的菌悬液备用（在600 nm处调整菌悬液光密度为0.5±0.02）。

挑选饱满、大小一致的K326裸种，70%的酒精消毒1分钟，无菌水清洗3次后均匀播于铺有2层滤纸的9 cm无菌培养皿中，每皿注入稀释10倍的上述菌悬液4 mL，每20粒种子为一个重复，每菌株3次重复，设置清水对照和LB培养液对照，置于人工智能气候箱中培养，（光强：70%；光照：12 h/d；昼夜温度：25℃；相对湿度：70%）每隔1 d补充无菌水1 mL，以确保种子正常萌发，于第7天分别统计发芽率，第14天测量烟苗根长、根体积。根长及根体积的测量采用加拿大Regent公司的WinRHIZO根系分析系统。

1.3.2 漂浮育苗试验复筛

将初步筛选出的促生细菌按1.3.1中方法制成菌悬液，种子消毒处理同1.3.1，利用漂浮育苗盘对初步筛选到的促生内生细菌进行再次筛选。在烟苗2片真叶时鉴苗，挑选成长整齐一致的的烟草幼苗移栽至漂浮育苗盘，用稀释10倍的上述菌悬液对烟苗进行喷雾处理，每个处理4株，5次重复，每株喷雾菌液5 mL。每隔7 d喷雾1次，以等量的无菌水和LB培养液处理作为对照，连续处理60 d，60 d后取样测量烟苗生长形态指标，最终筛选出烟苗促生细菌。

1.4 内生促生细菌wy2在烟草漂浮育苗中的应用效果研究

将菌株wy2接种于LB培养液中，于28℃、200 r/min的摇床中培养48 h后，12000 r/min离心后分别收集菌体（wy2菌）和上清（wy2），菌体用无菌水洗涤离心两次后重悬于无菌水中，在600 nm处调整菌悬液光密度为0.5±0.02即为菌体悬浮液。2011年9 - 10月在云南省烟草农业科学研究院研和试验基地采用温室漂浮育苗方式进行试验，在烟苗2片真叶时，分别用稀释10倍后的上清（wy2）及菌体悬浮液（wy2菌）喷雾处理烟苗，每个处理132株烟苗（一盘），2次重复，每盘喷雾200 mL。每隔7 d喷雾1次，以等量的无菌水和LB培养液处理作为对照，连续处理60 d，分别于第48 d、55 d、62 d取样测定每株烟草幼苗的茎鲜重、茎粗、茎高、根长。

1.5 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2003软件和DPS 7.5软件对数据进行统计分析。

1.6 内生促生细菌wy2的16S rDNA鉴定

细菌基因组DNA的提取用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit，方法参见试剂盒说明书。PCR扩增选用引物F27/R1492[13]，常规条件扩增[14]，扩增产物经TaKaRa Agarose Gel DNA Puri fication Kit回收后，连接于载体pMD18-T Vector，转入感受态细胞E.coliDH5α，挑取白色菌落以M13F/M13R为引物进行菌落PCR鉴定。阳性克隆委托上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，将测得的16S rDNA 全序列用EzTaxon server (http∶//www.eztaxon.org/)进行同源性搜索[15]，并用Mega 4.0软件，将该序列与已报道的芽孢杆菌菌株的16S rDNA全序列进行同源性比较，并建立系统发育树。

2 结果与分析

2.1 培养皿发芽试验初筛

通过在培养皿中进行的发芽试验，测定了127株内生细菌处理后烟草种子的发芽率、根长和根体积，淘汰了会不同程度降低烟草种子发芽率和抑制烟草种子萌发的菌株，在经过重复多次的发芽试验后筛选出了4株在不同程度上对烟草有促生性的内生细菌。从表1可以看出，水和LB培养液作用于烟草种子，平均发芽率分别为75.0%和81.7%。烟草种子经内生细菌cg15、cg16、wy2、wy3处理后，发芽率、根长和根体积与对照相比均有提高，发芽率提高了16.3%-20.3%，各菌株之间的差异顺序是：cg16＞wy2=cg15＞wy3。根长提高了25.1%-30.3%，各菌株之间的差异顺序是：wy2＞cg15=cg16＞wy3。根体积提高了50%-100%，各菌株之间的差异顺序是：wy2＞cg15=wy3＞cg16。菌液处理组与对照组差异均达显著水平。各处理烟草种子萌发的情况见图1，可见所有经内生细菌处理过的烟草种子根长均长于对照，菌液处理组在根的数量上也明显高于对照且子叶宽厚、叶色葱绿。说明cg15、cg16、wy2、wy3不仅能有效促进烟草种子萌发而且对烟草根系生长也有积极的促进作用。

表 1 不同菌株发酵液处理对烟草种子萌发、根长及根体积的影响

图1 内生细菌对烟草种子萌发的影响

2.2 漂浮育苗试验复筛

对培养皿发芽试验初筛得到的4株菌，通过漂浮育苗盘进行了进一步的筛选。参试菌株各项指标的综合评价见表2，除cg15外其余菌株各项指标的综合评价均好于清水对照和LB对照，其中以wy2最好，wy3次之，cg16第三。图2显示，所有经促生细菌处理过的烟苗根长均长于对照，菌液处理组较对照组根系更发达，而对照组根系长势较弱，根系不发达。从对茎直径的影响来看，wy2、wy3、cg16对茎直径的影响达显著水平，分别比LB对照增加了33.3%、17.8%和20.0%，cg15则没有显著地促进或抑制效果。从对根长的影响来看，除了cg15处理的根长低于对照组以外，其余菌株处理的烟苗根长较对照均有提高，但除了wy2以外，wy3和cg16处理与对照差异不显著，经wy2处理的烟苗根长比LB对照长出49.2%。从株高、茎鲜重、叶重、最大叶长最大叶宽来看，菌液处理的烟苗各项指标较对照有所提高，但变化不大，总体上与对照无明显差异。说明菌液处理对地上部分生物量没有显著的促进作用，对地下部分生物量有显著的促进作用。用以上各指标对各菌株的促生性做综合评价，其中以wy2对烟苗的促生效果最佳，顺序是：wy2＞wy3＞cg16＞cg15。

表2 参试菌株各项指标的综合评价

图2 内生细菌对烟草幼苗根长的影响

2.3 内生促生细菌wy2在烟草漂浮育苗中的应用效果研究

复筛结果表明，wy2对烟草的生长发育确实有明显稳定的促生作用，为了探究wy2的活性是由什么成分在起作用，是由菌体活细胞还是菌体的胞外分泌物，为此，我们分别用菌体活细胞悬浮液和菌体发酵液上清喷雾处理烟草漂浮苗，在株龄48 d、55 d、62 d调查每处理对烟草漂浮苗茎鲜重、茎直径、茎高和根长的影响。试验结果如图3、图4、图5、图6。图3显示，菌体活细胞悬浮液在株龄48 d和55 d对茎鲜重的影响达显著水平，平均比LB对照增重了0.22 g和0.56 g，在株龄62 d时菌体处理组虽然高于对照组，但与对照无显著差异。发酵液上清处理茎鲜重在整个生育期中都与对照无显著差异。图4显示，菌体活细胞悬浮液处理和发酵液上清处理在株龄48 d时对茎直径的影响达显著水平，平均比LB对照增粗了0.26 mm和0.05 mm，而在株龄55 d的时候，仅菌体悬浮液处理与LB对照有显著差异，相比LB对照处理，茎直径增粗了0.48 mm，发酵液上清处理茎直径与LB对照无差异。在株龄62 d的时候，菌体处理组虽然高于对照组，但与对照无显著差异。图5显示，在株龄48 d和55 d的时候，菌体悬浮液处理组茎高与LB对照相比差异达显著水平。茎高平均比对照增加了1.31 cm和1.46 cm，而发酵液上清液处理对茎高的影响未达显著。在株龄62 d的时候，两种处理茎高与LB对照相比差异不显著。图6显示，在株龄48 d的时候，菌体悬浮液处理根长与LB对照处理差异显著，根长平均比LB对照长70.61 cm。发酵液上清液处理根长与LB对照处理差异显著，与清水对照处理差异不显著。在株龄55 d的时候，菌体悬浮液处理组根长长于LB对照，但差异未达显著，与清水对照差异显著。发酵液上清处理与LB对照差异不显著。在株龄62 d的时候，两处理与LB对照都无差异。试验结果表明，菌体活细胞悬浮液对烟苗有比较明显和相对普遍的促生长作用。尤其是在株龄48 d和55 d的时候，烟苗的茎鲜重、茎粗、茎高、根长均高于LB对照，且与对照差异显著。而发酵液上清液在整个烟草苗床期中对烟苗的生长没有显著地影响，其茎鲜重、茎粗、茎高、根长与对照相近或比对照差。说明菌体是对烟草生长发育有促生作用的活性成分。发酵液上清液对烟草生长发育并无促生作用。

图3 促生细菌对茎鲜重的影响

图4 促生细菌对茎粗的影响

图5 促生细菌对茎高的影响

图6 促生细菌对根长的影响

2.4 内生促生细菌wy2的16S rDNA鉴定

测序结果表明菌株wy2的16S rDNA全序列长度为1514 bp，将测得的16S rDNA全序列用EzTaxon server (http∶//www.eztaxon.org/)进行同源性搜索[15]，与其同源性最高的菌为解淀粉芽孢杆菌相似性为99%。在Ribosomal Database数据库中选取10株属于Bacillus属的不同种的芽孢杆菌模式菌株构建系统发育树查看属种间的遗传进化关系（图7），从系统发育树看，wy11与B.amyloliquefaciens(GU826160)处于同一分支，说明两者的遗传进化关系最近，因此将菌株wy2鉴定为B. amyloliquefaciens(JQ936679)。

图7 菌株wy2的16S rDNA全序列系统发育树

3 讨论

本研究对127株烟草内生细菌进行了培养皿发芽试验，由于试验初期首先进行了皿内促生的浓度梯度预试验，发现内生细菌发酵液稀释10倍促生效果最为理想，因此本试验选用此浓度作为菌株发酵液的供试浓度。从中选出4个菌株作为重点菌，进一步对这4株菌进行了漂浮育苗试验复筛，最后挑选出1株对烟草的生长发育确实有明显稳定的促生作用的细菌wy2，经过温室漂浮育苗试验的验证，结果和复筛试验基本一致，表明通过这种筛选途径得到的促生菌株是有效的。wy2对烟苗根长的促进作用最为明显，推断wy2可能是通过促进根的生长和分节，增大根重，有效提高了幼苗的根系功能，从而更高效的促进烟苗对水分和养分的吸收，进而促进了叶片的光合作用，使得烟苗茎直径增加，鲜重增加。

本文在植物生育前期喷洒wy2菌液后，使苗床期烟苗在苗龄48 d和55 d时的茎鲜重、茎粗、茎高、根长得到不同程度的提高，这对于促进烟苗的早发快长是很有意义的。但在苗龄62 d的时候，各处理与对照差异不显著。可能因为接菌方法所致，叶面喷施促生细菌对烟草植株生态系的改造可能是暂时的，作用也是有限的，下一步可以探索最合适的接菌方法，以便从微生物角度使烟株长期处于一个最利于发挥丰产性状的稳定的微生态系。

在试验过程中，尤其是漂浮育苗试验，虽然每次结果4个菌株大都比对照有明显效果，尤其表现在对根长的促生方面，但是，同一菌株在不同试验地点、时间和试验次数中均表现出有一点差异，这意味着筛选到的促生内生细菌，由于生态环境条件等的不同，其作用效果常常会表现出某些不稳定性。

4 结语

筛选到的解淀粉芽孢杆菌wy2是烟草内生促生细菌，对烟草种子萌发、茎粗、根系生长有积极的促进作用，这与文献报道的植物内生细菌可以产生某些促生物质，并直接促进植物生长的结论一致[16]。由于菌株wy2处理对烟草幼苗的株高、最大叶宽、最大叶长没有显著影响，而只显著增加其茎粗和根长，说明内生细菌wy2的促生作用主要针对于输导组织，这为菌株的促生作用机理研究提供了方向。

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