汪君民，龚腾云

(南通大学 体育科学学院，江苏 南通226007)

视黄醇结合蛋白4(RBP4)主要是由脂肪细胞 分泌的，是特异性结合视黄醇的蛋白质中的一类[1]。研究发现，RBP4这一脂肪因子会导致胰岛素抗性，对胰岛素抗发展起到一个关键作用，在具有胰岛素抗性的小鼠体内及肥胖、2型糖尿病病人体内，血清RBP4的水平升高［2］。升高的RBP4水平与心血管危险因子关系密切，并且可用来作胰岛素抵抗程度的评价［3］。研究表明，运动训练可以降低不同年龄阶段的研究对象的RBP4水平［3，4］，提示运动可以通过RBP4水平的降低来提高胰岛素的敏感性。

已有很多研究发现胰岛素抵抗可导致高血压患者红细胞膜Na+-K+-ATP酶的活性减低，而有关胰岛素抵抗对心脏Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶影响的研究却不多，对于运动影响心肌细胞膜这两种酶变化状况更是未见报道，对胰岛素抵抗大鼠的淋巴细胞凋亡方面也缺乏研究。

本文采用重组RBP4注射活体大鼠，获得高RBP4诱导的胰岛素抵抗大鼠模型，观察运动后胰岛素抵抗和各指标变化，为临床控制胰岛素抵抗及糖尿病、心血管并发症以及提高胰岛素抵抗或糖尿病患者免疫功能提供新的思路。

1 研究材料与方法

1.1 材料

胰岛素(Sigma-Aldrich)、2-Deoxy-D-［I-3H］-glucose(Sigma-Aldrich)、RBP4ELISA试剂盒(Biosource)、胰岛素放射免疫试剂盒(Biogenesis)、重组RBP4(Alexis)、鼠GM-CSF ELISA试剂盒、淋巴细胞亚群检测试剂盒、考马斯亮蓝G250蛋白测定试剂盒、ATP酶测试盒、凋亡细胞试剂盒均购自厦门慧嘉生物技术公司。酶联免疫检测仪，流式细胞仪(FCM)(Beckman Coulter)等仪器。操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.2 方法

1.2.1 重组RBP4注射与运动方案

雄性SD大鼠8周龄22只，体重183～211g，随机分成RBP4+运动组(RE)10只、RBP4安静组(RR)6只，2组大鼠给予重组RBP4腹腔注射［2］，3μg/g体重，每12小时一次，持续注射4周。其余6只为正常安静对照组(C)。RE组大鼠按照Ploug方法［5］进行游泳训练4周，泳池为直径53cm内壁光滑的塑料桶，水深70cm，水温为35±2℃，游泳训练开始时间为晚上6点;大鼠先进行每天15分钟适应性游泳训练共2天，从第3天开始采取每天无负重游泳，每次持续60min，每周训练6天，周日休息，共持续4周。训练中，大鼠如出现反复下沉或溺水倾向，及时捞出，休息后片刻，再投入水中，直至补足60min训练时间;同时使用小木棍及时驱赶，使大鼠持续运动，避免其出现抱团、漂浮等现象，保证训练效果。将正常安静对照组大鼠在浸水后捞出。游泳结束后捞出，以干毛巾擦拭，暖风机吹干。

1.2.2 血清RBP4和胰岛素抵抗指数的检测

采用双抗体夹心酶标免疫分析法测定RBP4;采用放射免疫分析法测定胰岛素。采用稳态模式评估法评价胰岛素敏感性，其原理是:假设外周组织和肝脏的胰岛素抵抗相等，按胰岛素和血葡萄糖在周围组织、肝和胰腺等器官相互影响而建立起来的数学模型。模型的计算公式为:HOMA-IR(胰岛素抵抗指数)=空腹胰岛素(国际单位/L)×以空腹葡萄糖(mmoL/L)/22.5。

1.2.3 心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性检测

无菌取出心脏，PBS洗去血液。去外膜后用眼科剪将其剪成1 mm3大小的组织块，称重约0.2 g心室肌与预冷的匀浆介质1∶9混合(匀浆介质组成:Tris1·21g/L、EDTA-Na237·23 mg/L、蔗糖34·2 g/L、再以HCl滴定至pH值为7·4)，在玻璃匀浆器中研磨制成10%的混悬液，以3 000 r/min离心10 min，取上清液(即心肌匀浆)放置-20℃冰箱中低温保存。检测时，1 ml生理盐水清洗细胞3次，0.25%的胰蛋白酶消化细胞，细胞计数后，1000r/min离心5 min，用生理盐水将细胞打成悬液，混匀后，超声波细胞粉碎机破碎细胞，然后按照Na+-K+-ATP酶测试盒说明书(化学比色法)要求测定，实验重复4次。Ca2+-ATP酶活性与此类似。

1.2.4 大鼠血清中GM-CSF水平检测

本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗鼠GM-CSF单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的GM-CSF与单抗结合，加入生物素化的抗人GM-CSF，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在492nm处测OD值，GM-CSF浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中GM-CSF浓度。

1.2.5 免疫学指标

CD4、CD8的活性测定用S-P一步法;均参照试剂盒说明书进行操作;胸腺及脾脏指数:用分析天平称取胸腺及脾脏重量后，计算依据下列公式:胸腺(或脾脏)指数(g/100g)=100×胸腺(或脾脏)重量/体重。

1.2.6 胸腺细胞凋亡光镜观察

实验结束后断头处死动物，取出胸腺进行凋亡细胞原位末端标记及观察。采用TUNEL方法［6］:将制备的胸腺组织石蜡切片脱蜡、乙醇水化，PBS冲洗后蛋白酶K消化，TDT酶/生物素-dUTP反应液等处理(具体步骤按试剂盒说明进行)，最后二甲苯透明，树胶封固，显微镜下观察结果并摄像。阳性标准为核呈棕红色、背景清晰。

1.3 数据处理

所有数据均采用SPSS19.0程序处理，数据以均数±标准差(±S)表示，由于HOMA-IR为非正态分布，经对数转换后再进行分析。组间进行方差分析，相关分析采用简单相关。采用LSD检验，P＜0.05为差异具有统计学意义，P＜0.01为差异具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 血清RBP4和胰岛素抵抗指数变化

4周后，RE组和RR组大鼠血清RBP4水平显著高于C组(P＜0.01);RE组大鼠血清RBP4水平显著低于RR组(P＜0.01);RE组和RR组大鼠HOMA-IR显著高于C组(P＜0.01);RE组大鼠HOMA-IR显著低于RR组(P＜0.01)(见表1)。

表1 血清RBP4和胰岛素抵抗指数变化

2.2 大鼠心肌Na+－K+－ATP酶和Ca2+ATP酶活性

表2 大鼠心肌Na+－K+－ATP酶和Ca2+－ATP酶活性

2.3 大鼠血清中GM－CSF水平变化

表3 大鼠血清中GM－CSF水平

2.4 外周血中CD4、CD8活性及CD4/CD8比值变化

表4 外周血中CD4、CD8活性及CD4/CD8比值变化

4周后，RR组和C组大鼠外周血CD4、CD8活性及CD4/CD8比值差异不大;RE组大鼠外周血CD4活性明显高于RR组(P＜0.05)，而CD8活性明显低于RR组(P＜0.05);其比值高于RR组(P＜0.01)。

2.5 大鼠体重、胸腺指数、脾脏指数的变化

表5 大鼠体重、胸腺指数、脾脏指数的变化

4周后，RR组与C组大鼠相比，体重、胸腺指数、脾脏指数都有所下降(P＜0.05);而RE组与C组大鼠相比体重无显著差异，与RR组比胸腺指数(P＜0.05)、脾脏指数明显提高(P＜0.01)。

图1 各组胸腺皮质、髓质光镜下细胞凋亡情况

2.6 观察大鼠胸腺细胞凋亡的数量及分布部位

正常安静对照组(C):在胸腺皮质及髓质部位均能见被着染成棕红色的凋亡细胞，阳性细胞占整个胸腺细胞比例较少。

RBP4安静组(RR):在胸腺皮质及髓质部位见棕红色的凋亡细胞较正常对照组明显增多，阳性细胞占整个胸腺细胞的比例增大。

RBP4+运动组(RE):在胸腺皮质及髓质部位见棕红色的凋亡细胞似较正常安静对照组增多，但较RBP4安静组明显减少。

3 讨论

3.1 大鼠血清RBP4变化情况

胰岛素抵抗不仅是2型糖尿病的发病基础，还是代谢综合征(糖尿病、肥胖、高血压病、动脉粥样硬化、脂肪肝等疾病)的共同的病理基础。胰岛素能够提高组织对葡萄糖的摄取率，机制是胰岛素与靶细胞的胰岛素信号蛋白相互作用，最终能够增加葡萄糖转运体从细胞内池向细胞膜的运动［7］。胰岛素在不同的组织、细胞中通过复杂的信号级联放大作用发挥不同的生理作用。本研究中大鼠经过RBP4注射4周后，与C组相比，RE组和RR组大鼠均出现胰岛素抵抗;对RBP4注射后的大鼠进行运动干预后发现，虽然大鼠血清RBP4水平仍高C组，但与RR组比明显下降。与此对应的是:RE组和RR组大鼠胰岛素抵抗指数显著高于C组，RE组大鼠明显低于RR组。说明运动能够抵抗RBP4诱导的胰岛素抵抗。

3.2 大鼠心肌Na+－K+－ATP酶和Ca2+－ATP酶活性

Na+-K+-ATP酶又称钠泵。该酶可水解ATP释放能量逆电化学梯度实现Na+和K+跨膜转运，把动作电位去极相进入胞浆的Na+转运到胞外，把复极相流出的K+运回胞内。正常状态下胰岛素直接作用于血管平滑肌或刺激血管内皮释放NO，激活Na+-K+-ATP酶，促进Na+-H+交换，使细胞膜超极化，Ca2+通道关闭，从而介导糖摄取和血管舒张。但随着胰岛素抵抗程度加深和/或内皮功能障碍的加重，血管活性物质(包括胰岛素)作用力相对降低，导致内皮eNOS表达及活性降低，NO介导的血管扩张受损［8］。内源性内皮细胞功能障碍导致的细胞膜损伤可通过改变胰岛素受体的表达或功能，以影响葡萄糖的清除而参与胰岛素抵抗的发生。

Na+-K+-ATP酶对胰岛素敏感，当发生胰岛素抵抗时，动脉壁平滑肌细胞上的Na+-K+-ATP酶活性降低，细胞内Na+、Ca2+增加，血管壁对升压物质的反应性增加［9］。Smith等［10］认为Na+-K+-ATP酶活性变化不因糖尿病的细胞代谢障碍引起，而是由上皮因子和胰岛素等引起酶的调节改变所致。Pollock CA等［11］应用电子微探头X射线分析技术测量STZ诱导的SD大鼠早期糖尿病肾病的各项指标，发现胞内Na+明显增加，肾小球滤过率明显高于正常安静对照组，认为糖尿病肾病高滤过期时近端小管的Na+-K+-ATP酶活性增加。

本试验发现:心肌Na+-K+-ATP酶活性在RE组较RR组明显升高，与糖尿病早期的结果类似，也与上述研究相符，说明胰岛素抵抗大鼠可能存在肾小球高滤过而造成肾小管高重吸收，肾髓质小管Na+-K+-ATP酶活性增高，负担加重。胰岛素对健康人、肥胖患者以及糖尿病患者的肾脏钠转运和血压均有影响。目前已经证实胰岛素可以直接影响甚至肾脏中的钠通道、磷酸钠协同转运蛋白、Na+/H+交换器NH3以及Na+-K+-ATP酶等的表达及活性［12］。Sowers JR认为:胰岛素可调节细胞膜上Ca2+-ATP酶活性，以维持Ca2+浓度最适水平，而在胰岛素抵抗时，这种调节降低或消失，使Ca2+浓度增加，导致周围血管张力增加，血压升高［13］。但本研究显示RE组Ca2+-ATP酶活性与正常安静对照组和RR组相比无显著差异，与上述研究不同，或许这和实验条件不同以及胰岛素抵抗程度差异有关，需要进一步研究。

3.3 大鼠血清中GM－CSF水平变化

GM-CSF是一种来源于T、B淋巴细胞、巨噬细胞、纤维细胞及间质细胞的一种糖蛋白，在炎症反应过程中由损伤内皮细胞释放的一种多肽类激素样造血生长因子，它可促进造血祖细胞分化成单核巨噬细胞，并维持单核巨噬细胞的生长、增殖、分化为炎症反应的敏感的标志物［14］。它可刺激骨髓早期母细胞分化，促进成熟和增殖，对机体的抗感染、免疫、造血都具有重要的调节和促进作用。是联系生物体内三大调节系统的重要介质。它可通过影响网络调节系统，引起免疫调节功能的紊乱，特别是表现在T、B细胞比例发生紊乱，使CD4/CD8比值发生改变。［15］

本文结果表明，RR组血清中GM-CSF水平非常显著地高于正常安静对照组(P＜0.01)，而RE则与正常安静对照组比较无显著差异(P＞0.05)，这一结果表明，血清GM-CSF确实与胰岛素抵抗发生和发展密切相关。其升高的机理有可能是:由于大鼠胰岛素抵抗导致细胞免疫功能受到抑制，大鼠机体存在非特异性免疫调控增强之故。但具体是由于过度活化的T细胞分泌增加所致，还是其他因子分泌增加所致，抑或是骨髓干细胞及基质细胞异常分泌增加所致尚需深入研究。

3.4 大鼠外周血CD4、CD8活性及CD4/CD8比值变化

机体特异性免疫的重要组成部分之一是细胞免疫，T淋巴细胞是细胞免疫的效应细胞。其中CD4+T细胞主要是识别外源性多肽抗原，包括辅助性T细胞(Th)和诱导性T细胞(TI);CD8+T细胞主要是识别内源性多肽抗原，包括细胞毒性T细胞(Tc)和抑制性T细胞(Ts)两种。CD4+和CD8+通过相互制约来维持免疫功能的平衡，二者的比值下降提示免疫抑制。

本研究测定结果，RE组大鼠外周血CD4活性明显高于RR组，CD8活性明显低于RR组，CD4/CD8比值明显增加。揭示运动训练对胰岛素抵抗大鼠的免疫功能有一定的正性调节作用。

3.5 大鼠体重、胸腺指数、脾脏指数组间关系

胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，其结构、功能的正常与否直接关系到机体的免疫功能是否正常。胸腺是T淋巴细胞发育、成熟的部位，为中枢免疫器官。人类的胸腺在出生时就已发育完全，以后随年龄的增长而逐渐变大，至青春期达高峰，青春期过后胸腺渐萎縮。脾是人体最大的外周免疫器官，是B淋巴细胞发育、成熟的，也是机体在抗原刺激下发生免疫应答的场所。故胸腺、脾脏结构的衰退和功能下降势必会影响机体的体液、细胞免疫功能，导致机体免疫功能失调。胸腺指数和脾指数是依据机体体重来计算的，与体重成正比，故胸腺指数、脾指数是直接反映胸腺、脾免疫功能的重要指标［16］，两者的高低变化反映了机体体内免疫功能的状态。

本实验结果显示RR组大鼠体重、胸腺指数、脾脏指数均低于正常安静对照组C组，表明RBP4诱导的胰岛素抵抗明显降低大鼠体重胸腺指数、脾脏指数。而RE组胸腺指数、脾脏指数均高于RR组，则说明耐力运动能显著提高模型大鼠胸腺指数及脾脏指数，提高机体免疫力，增强防病抗病能力。

3.6 研究缺陷和进一步研究的方向

本试验只采用了游泳这种单一的练习方式，没有设置专门的力量练习组。而有文献认为，适当的力量或抗阻力方案设计对不适合进行走、慢跑、有氧健身操等练习的2型糖尿病患者是可行而且有效的。具体采用的运动方式、运动强度、频度、持续时间等都还需要更多的运动试验进行探讨。

方案设计中缺少了肾脏细胞凋亡的检测，胰岛素抵抗可能会引起肾脏细胞更容易凋亡，从而提高糖尿病肾病的发生机率。

4 结论

运动能提高RBP4诱导的胰岛素抵抗大鼠心肌Na+-K+-ATP酶的活性，提高心肌传导和离子转运能力;运动能够明显减少RBP4诱导的胰岛素抵抗大鼠胸腺细胞凋亡，提高免疫能力。该研究在探讨胰岛素抵抗患者和糖尿病患者免疫功能下降发生机制、临床治疗和预后判断方面有重要意义。

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