向 浩，张晓东，凌英会，丁建平＊，章孝荣＊

（1.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥230036；2.安徽地方畜禽遗传资源保护与生物育种省级实验室，安徽合肥230036）

MicroRNA（miRNA）是一类长约21～24nt的单链小分子RNA，是非编码RNA 家族的重要成员之一，一般通过碱基配对的方式与靶mRNA 的3′非翻译区（3′Untranslated Regions，3′UTR）结合，从而降解靶mRNA 或抑制其表达，但并不影响其转录，它们在植物、线虫到人类的细胞中均广泛存在［1］。1993年，Lee等［2］研究人员最先发现miRNA是在秀丽新小杆线虫（C.elegans）中控制线虫时序性发育的小分子RNA：lin－4；时隔7年之后，Reinhart等［3］发现了另一个具有转录后调节功能的小分子RNA：let－7；在之后的几年时间里，大量长度类似的小分子RNA 被相继发现，并被研究人员命名为microRNA（miRNA）［4］。据推测，人类基因组中约有2／3的基因受到miRNA 的调控，而且miRNA 与靶基因之间广泛存在着“一对多”和“多对一”的关系，这使得机体内miRNA 与靶基因之间存在复杂的调控网络［5］。

研究表明，miRNA 与哺乳动物的性腺功能及繁殖性状密切相关。miRNA 在哺乳动物的卵巢和睾丸等生殖器官、组织中广泛表达，其表达量随性腺发育呈现动态变化，且能通过与性腺激素的相互作用而影响性腺发育及其内分泌活动，对卵巢和睾丸的正常发育影响巨大；另外，miRNA 还能促进卵母细胞的成熟和精子的分化，对受精卵发育也有重要的调控作用。

1 miRNA 的生物合成与作用方式

miRNA 的生物合成途径（图1）可分为多个步骤。首先，miRNA 基因由RNA 聚合酶II转录成长链初级miRNA（pri－miRNA），接下来，这些初级miRNA 经过分步分区处理，最终形成成熟的miRNA。在这个过程中，长片段的初级miRNA 首先在核内被Ⅲ型RNA 核酸内切酶Drosha剪切成约70～90 个碱基大小的前体miRNA（pre－miRNA），Drosha和双链RNA 结合蛋白DGCR8共同作用形成了一个微型的络合物［6］；接着Pre－miRNA 在输出蛋白5（Expotin－5）的帮助下从核内转运至胞质（Ran－GTP 作为辅助因子），在胞质内，经过Ⅲ型RNA 核酸内切酶Dicer剪切成约22个核苷酸的双链miRNA［7］；最后，双链miRNA 被拆分成单链的成熟miRNA［8］。

成熟的miRNA 与RNA 诱导的沉默复合体（miRISC，也被称作核糖核蛋白复合体（miRNP））结合而发挥作用。在RISC上，miRNA 可以通过两种不同的方式下调控靶基因的表达（图1），即抑制翻译或降解靶mRNA，具体是哪种方式由miRNA 和靶基因结合蛋白Argonaute家族的互补程度决定：完全互补则会降解靶mRNA，只有部分互补则会抑制其翻译［9－10］，准确的翻译抑制机制目前尚不清楚。以mRNA 为靶目标的miRNA 可能会被扣押在核糖体上［11］，或者被补充到细胞质处理小体（Pbodies）中，并最终被降解［12］。

图1 miRNA 的生物合成过程及作用方式［13］Fig.1 The mode of biosynthesis and action of miRNA

2 miRNA 与卵巢功能

2.1 miRNA 与卵泡发育

研究表明，卵泡的正常发育和排卵的正常进行，需要大量基因表达产物的参与协调，且必须保证这些基因表达和信息交流在时空上的准确性，而miRNAs在此过程中也起到了重要作用。Tang等［14］对小鼠成熟卵细胞中的miRNAs进行了检测，结果发现了miR－30、miR－16、let－7 以及miR－l7－92 家族等多种miRNAs。Alford等［15］通过研究从妇女体内得到卵母细胞的颗粒／卵丘细胞发现，其中也存在着如miR－23a、miR－23b、miR－17－5p、miR－211和miR－542－3p等多种miRNAs。Munir［16］等通过建立牛卵巢miRNA 文库发现了50 个已知的和24 个新的miRNA 克隆，其中Bta－miR－29a在卵泡细胞的各个发育阶段均特异性表达。Hyo等［17］为了查明小鼠新生儿（NB）卵巢中miRNA 的表达情况，对小鼠NB卵巢组织中提取的miRNA 进行了测序。结果显示，let－7家族的表达最为丰富，MMU－MIR－672、MMU－MIR－322、MMU－miR－503和MMU－MIR－465家族是表达最丰富的X 染色体－连锁的miRNA。其中，MMU－miR－503、MMU－MIR－672 和 MMUMIR－465在睾丸和卵巢中优先表达［17］。

2.2 miRNA 与卵母细胞成熟

Murchison等［18］研究发现，在生发泡期的卵母细胞中，Dicer1的表达量很高，而随着卵母细胞的逐渐成熟以及受精活动的进行，其表达量逐渐降低，到2－细胞胚胎时其表达量降到了最低值。对卵母细胞特异性Dicer1－／－鼠（Dicer敲除小鼠，导致Dicer的表达量大幅下降）的研究表明，在卵母细胞的成熟过程中，miRNA 起到非常重要的作用，对Dicer1－／－鼠减数分裂时期的卵母细胞进行芯片分析的结果显示，共有861个mRNA 上调，而有173个mRNA 下调。由此推测，在卵母细胞中，miRNA 可能是通过对这些转录产物的调控来调节卵母细胞的成熟。Yao［19］等研究发现，MicroRNA－224通过和靶基因Smad4的作用来参与转化生长因子β介导的小鼠颗粒细胞的增殖和功能。而Martha等［20］研究发现，miR－21有阻碍小鼠排卵前颗粒细胞凋亡的功能。

2.3 miRNA 与卵巢性腺激素

Lam 等［21］发现，在雌性正常的生殖过程中，卵巢雌激素和孕酮的周期性变化对于排卵、胚胎着床和月经周期等是必不可少的环节。最近大量的研究表明，miRNA 通过与卵巢性腺激素之间的相互影响，实现对雌性动物生殖过程的调控。

一方面，类固醇激素影响miRNA 的生成。Pan等［22］发现，原代培养的人子宫内膜间质和腺上皮细胞经过17β－雌二醇和乙酸甲羟孕酮处理后，miR－20a、miR－21 和 miR－26a 的表达受到了影响。Yamagata等［23］研究发现，活化的雌激素受体（es－trogen receptor，ER）能通过与Drosha的相互作用来抑制pri－miRNAs的成熟，并最终导致这些miRNAs所作用的靶基因表达量增大。此外，Kuokkanen等［24］比较了人增殖期和分泌期子宫内膜中miRNAs的表达差异情况，结果显示，与增殖期相比，有miR－29b、miR－29c、miR－30b、miR－30d、miR－31、miR－193a－3p、miR－200c、miR－203、miR－204、miR－210、miR－345和miR－582－5p共12个miRNAs在分泌期表达量显著升高，而孕酮在此过程中起到了关键性的作用。

另一方面，miRNAs同样会影响卵巢类固醇激素的生成。Sirotkin 等［25］研究了miRNAs对人卵巢细胞分泌的主要性腺类固醇激素的影响，体外研究结果显示，如分别转染let－7b、let－7c和mir－15a等36种miRNAs，可提高人颗粒细胞孕酮的分泌量，而mir－16、mir－24和mir－25等10、51和57种miRNAs则会分别使孕酮、睾酮和雌二醇表达量降低，且有的抑制作用可高达4.5倍。有意思的是，Alexander等［26］也做了相似的研究，结果发现，在检测的80种miRNA 中，有36种抑制孕酮的分泌，而有10种促进孕酮的分泌。

此外，除类固醇激素外，促性腺激素也能调节miRNAs的生成。Fiedler等［27］对人排卵期卵泡颗粒细胞的研究发现，有13个miRNAs受LH（黄体生成素）调节，且对miR－132 和miR－212 这两个miRNA 的上调作用明显。Yao等［28］在体外培养了大鼠的颗粒细胞，并研究了孕酮对其miRNA 表达量的影响，结果发现，用孕酮对颗粒细胞处理12小时后，miR－29A 和miR－30D 的表达量显著下调；而处理48h 后，他们的表达量都增加。Yao等［29］发现，FSH（卵泡刺激素）对小鼠颗粒细胞中let－7a、miR－125b和miR－143的表达具有抑制作用。Yong等［30］研究了hCG（human chorionic gonadotrophin，人绒毛膜促性腺激素）对体外培养的小鼠卵泡细胞和颗粒细胞中miRNA 表达的影响，结果发现，相对于不添加hCG 的组，添加hCG 的卵泡细胞中miR－126，miR－143 和miR－721 的表达量下调；而添加hCG 的颗粒细胞中mmu－let－7b 表达量下调，其他的miRNA 的表达量在两种细胞中没有明显差异。

3 miRNA 与睾丸功能

3.1 miRNA 在睾丸中的表达

对于miRNA 在哺乳动物睾丸中的表达情况，研究人员们也做了一些研究。Yan等［31］以灵长类动物的睾丸组织为材料进行了研究，结果在恒河猴的未成熟和成熟的睾丸组织中共检测到66个（占总数的26.4%）差异表达的miRNA，其中23个上调，43个下调；而在人的未成熟和成熟的睾丸组织中共检测到76个（占总数的31.3% ）差异表达的miRNA，其中有28 个上调，48 个下调。这些miRNAs可能调控精母细胞和精细胞在精子发生过程中的形成和分化。Lian等［32］研究发现，miR－122的表达量在成年猪的睾丸发育成熟的过程中逐渐升高；而miR－221的表达量在此过程中逐渐降低，这个结果说明miR－122和miR－221可能在睾丸的发育过程中起到不同的作用。他们在2012年分别建立了未成熟和成熟猪睾丸组织的小RNA 文库，检测发现了389种已经发现的或同源性的miRNAs，15种新的在猪上特异表达的miRNAs和56 个新的候选miRNAs。其中有122个miRNAs在未成熟和成熟猪睾丸组织中差异表达，且其中的10种经RT－PCR进行了验证［33］。

3.2 miRNA 与精子发生

与正常的体细胞不同，成熟的精子作为生殖细胞是一种特殊的单倍体细胞，其正常发生要经历一系列复杂的过程，离不开众多与之相关因子之间的精准调控。Katsuhiko等［34］发现，在小鼠精子发生过程中，miR－17－92 家族和miR－290－295 家族在精原细胞中高表达。Tong等［35］研究发现，miR－17－92和miR－106b－25可能会使Bim，Kit，Socs3 和Stat3的表达量下调；miR－17－92敲除小鼠会出睾丸缩小、产精数减少和精子发生减弱的现象；在精细胞内，miR－17－92表达量的减少会增加miR－106b－25的表达量，这些结果表明，miR－17－92和miR－106b－25可能通过相互协作的方式来调节精子发育。Liang等［36］研究发现，miR－34C 在精子细胞中高度表达，它能通过与靶基因ATF1的作用促使小鼠雄性生殖细胞凋亡。Mciver等［37］比较了小鼠精原细胞和精母细胞表达miRNA 的差异情况，结果显示miR－293、miR－291A－5P、miR－290－5p和miR－294 表达量上调，miR－136、miR－743a和miR－463表达量下调。

4 miRNA 与受精卵发育

受精卵是哺乳动物个体发育的起点，精卵融合成受精卵，并逐步发育成早期胚胎乃至个体，对于miRNA 与之的关系，也有人做了相关研究。Tang等［14］研究发现miR－17－92和let－7家族是受精卵中含量最丰富的母源miRNAs，他们进一步分析了在未成熟卵子逐渐发育成早期胚胎的过程中，未成熟卵子、成熟卵子、受精卵以及早期胚胎miRNA 的表达谱差异，结果显示，miRNA 的表达量会出现先降低，之后又上调的情况。此外，Tripurani等［38］发现，miR－196a 通过表达量的持续升高，导致NOBOX（新生儿卵巢同源盒基因）的表达量降低，从而调节小鼠的早期胚胎发育。Ronald等［38］对小鼠的早期胚胎的研究表明，miR－135A 能通过下调靶基因SIAH1A 的表达量来调节早期胚胎的体外发育。

5 小结

miRNA 能够通过与靶mRNA 特异性的碱基配对引起靶mRNA 的降解或者抑制其翻译，从而实现对基因转录后表达的调控。研究表明，miRNA广泛参与哺乳动物卵泡发育、精子发生、激素分泌、受精卵发育、妊娠维持等重要的生殖活动，与哺乳动物的性腺发育关系密切。但这其中还存在着一些问题，比如这些结果主要来自于小鼠和人，在其他哺乳动物上的研究还有待深入；有些是体外试验的结果，在体内的情况还不太清楚；而且，虽然越来越多的miRNA 已用不同的方法成功鉴定出来，但是单一某种miRNA 在哺乳动物生命活动中的作用及其机理也还有待更加深入的研究。

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