焦仁刚，杨永强，龚 俞，惠嫣婷，刘若余＊

（1.贵州省畜牧技术推广站，贵州贵阳550001；2.贵州大学动物科学学院／高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室／贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州贵阳550025）

Janus激酶或信号转录因子及活化子（Janus kinase／signal transducer 和activator of transcription）（JAK－STAT）是最重要的细胞因子和生长因子信号通路之一［1］。生长激素（Growth hormone，GH）通过与细胞表面受体结合激活胞内信号转导反应，调控细胞生长和分化。GH 信号通路由细胞表面的生长激素受体（Growth hormone receptor，GHR）二聚体化引发，进入JAK－STAT 信号通路引发磷酸化级联反应，GHR 活化后进而磷酸化下游的STAT 蛋白，STAT 蛋白以二聚体形式进入核内，作为转录因子调控相关基因表达［2］。STAT 蛋白是胞质中潜在的转录因子，含有SH2结构域，酪氨酸磷酸化位点和DNA 结合和反式激活域［3］。GH 信号通路主要由STAT1、STAT3、STAT5A 和STAT5B 参与调控相关基因表达［4］。STAT1 与STAT3形成异源二聚体或单独形成同源二聚体结合到c－fos等基因启动子进而调节其表达水平［5］。

Cobanoglu等［6］利用DNA 池在牛STAT1 基因鉴定到1个SNP位点，其中等位基因C显著提高奶牛乳脂率和乳蛋白率。基因启动子变异通过改变RNA 聚合酶和转录因子与顺式作用元件的结合影响基因表达水平。目前对于牛STAT1基因启动子多态性研究极少，本试验为筛选STAT1 基因启动子区SNP及研究其对启动子功能元件的影响，选择贵州地方优良品种务川黑牛和贵州荷斯坦奶牛两种品种差异明显的品种构建DNA 池，直接测序后DNAstar软件进行序列拼接和校正，BLAST 分析STAT1基因多态性，并与NCBI中SNP 数据库进行比较，首次在牛STAT1 基因启动子区筛查到SNP位点。生物信息学软件预测序列核心启动子区和CpG 岛，并分析SNP 位点对转录因子结合位点和RNA 二级结构等影响。

1 材料与方法

1.1 DNA 提取与DNA 池构建

54个贵州荷斯坦奶牛血样采自贵州贵阳三联乳业公司第二奶牛场，务川黑牛血样45个采自贵州务川仡佬苗族自治县仡佬牧业公司种牛场。血液基因组提取试剂盒（生工生物工程有限公司）提取牛DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取效果，每个DNA 样品浓度使用紫外分光光度计测量3 次，取平均值。务川黑牛和贵州荷斯坦奶牛DNA 样品分别调整相同浓度至100ng／μL，各取5μL 混合构建成2个DNA 池。

1.2 引物设计和DNA 扩增

以牛STAT1（GenBank 登录号：AC＿000159.1）DNA 序列，利用Primer－BLAST 设计1对特异性引物，上游引物为：5＇－CTGAGCTTCAAAGCCTCCAGA－3＇；下游引物为：5＇－GGTCCAACAAGTTTTGAGTCCTG－3＇。PCR 扩增得到STAT1 基因5＇调控区及第1外显子总长1 122bp。构建DNA 池进行PCR 反应，PCR 反应体系为25μL：2×Taq PCR Master Mix试剂12.5μL，上、下游引物（浓度为10 pmol／μL）各1.5μL，基因组DNA 2.5μL，三蒸水7 μL。采用Bio－Rad公司PCR 扩增仪进行DNA 扩增，PCR 扩增条件为：94 ℃预变性4min；94 ℃变性40s，61.5 ℃退火45s，72 ℃延伸50s，35个循环，72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像系统观察电泳结果。

1.3 序列分析

把特异性好的PCR产物委托诺赛基因组研究中心有限公司进行双向测序，特异性不好的PCR 产物利用DNA 纯化回收试剂盒（北京博迈德科技发展有限公司）进行纯化后测序，3次独立测序。用DNAstar软件对测序结果进行校正，BLAST分析确定SNPs。

1.4 生物信息学分析

生物信息学软件根据数学模型或不同算法预测结果，不同软件可能因计算方法和阈值设定的差异得到不同预测结果，利用多种软件比较分析可最大限度提高预测准确性，充分发挥其参考价值。将突变前后序列递交在线软件，得到预测后进行分析。

（1）启动子预测：Promoter SCAN ：http：／／www－bimas.cit.nih.gov／molbio／proscan／；Neural Network Promoter Prediction：http：／／www.fruitfly.org／seq＿tools／promoter.html；Promoter 2.0：http：／／www.cbs.dtu.dk／services／Promoter／；Softberry：http：／／linux1.softberry.com／

（2）转录因子结合位点预测：Tfsitescan：http：／／www.ifti.org／；TESS ：http：／／www.cbil.upenn.edu／cgi－bin／tess／tess；TFSEARCH：http：／／www.cbrc.jp／research／db／TFSEARCH.html；Softberry：http：／／linux1.softberry.com／cgibin／programs／promoter／nsite.pl；GeneBuilder ：http：／／zeus2.itb.cnr.it／～webgene／genebuilder.html

（3）RNA 二级结构预测：Genebee：http：／／www.genebee.msu.su／services／rna2＿reduced.html；EVOLGA：http：／／wwwmgs.bionet.nsc.ru／mgs／programs／2dstructrna／evolga.html.

（4）CpG 岛预测：Bio－soft：http：／／www.biosoft.net／sms／cpg＿island.html；MethPrimer：http：／／www.urogene.org／methprimer／index1.html；Webgene：http：／／zeus2.itb.cnr.it／cgi－bin／wwwcpg.pl；Softberry：http：／／linux1.softberry.com／berry.phtml？topic ＝cpgfinder＆group ＝programs＆subgroup ＝promoter； CpG Island Searcher ：http：／／www.uscnorris.com／cpgislands2／cpg.aspx.

图1 务川黑牛和贵州荷斯坦奶牛STAT1基因DNA 池检测M.DL 2 000 Marker；1.务川黑牛DNA 池PCR 产物；2.贵州荷斯坦奶牛DNA 池PCR 产物Fig.1 Results of DNA pooling of STAT1in two breedsM.DL 2 000 Marker；1.DNA pooling of Wuchuan black cattle；2.DNA pooling of Guizhou Holstein cow

2 结果与分析

2.1 DNA 池的PCR 产物测序

设计特异性引物分别扩增出务川黑牛和荷斯坦奶牛STAT1基因目的序列共1 122bp，见图1。扩增产物经胶回收纯化后进行3 次独立双向测序，BLAST 分析共发现3个SNPs，以STAT1基因第1外显子第1 位为＋1 位，SNPs 位点分别为：T－537G、T－508A、C＋10T（图2）。对于2个生长性能差异明显的牛种，务川黑牛生长性能优于荷斯坦奶牛，而荷斯坦奶牛产奶性能较务川黑牛更好。T－537G 多态性位点在两个牛种中均存在，该突变位点是否造成其生长性能差异需进一步研究。贵州荷斯坦奶牛T－508A、C＋10T 两个位点均出现杂合子，而务川黑牛在该位点并不表现多态性，该位点可能对两个品种产奶性能有一定影响。

2.2 STAT1基因启动子预测

利用4种不同软件对测序得到的STAT1基因调控区序列进行启动子预测，仅有Neural Network Promoter Prediction软件发现2个可能的核心启动子区域，第－14～＋36bp评分为0.71，＋245～＋295范围评分达到0.92（表1）。说明STAT1基因5＇调控区具有的软件可识别启动子特征不明显。本研究所发现C＋10T 位点处于核心启动子区域，并且靠近转录起始位点，可能在调控STAT1 基因表达中发挥重要作用，而另两个SNP位点可能作用于其他调控区域而影响基因表达水平。

图2 STAT1基因DNA 池的PCR 产物测序和BLAST 分析Fig.2 Sequencing and BLASTof STAT1PCR products

表1 启动子预测结果Table 1 Results of promoter prediction

2.3 STAT1基因5＇调控区转录因子结合位点预测

采用Tfsitescan、TESS、TFSEARCH 等5种生物学软件对STAT1基因转录因子结合位点进行预测和综合分析（表2）。结果表明：递交序列包含TFⅡD、Pit－1、IRF－1、IRE、γ－IRE、γ－globin、FOX protein、AP－2、C／EBP、SP1 等对STAT1 基因表达起重要调控作用的转录因子结合位点，并有TATA box、GC box、CCAC box等启动子重要元件结合位点。将突变后的序列重新提交，比较发现突变造成从－510位开始，新产生GATA－1＿CS2、NF－E1.2、NF－E1＿CS1、NF－E1＿CS2、GATA－1－EpoR、GATA－1－MC－CPA、GATA－1＿CS1、GATA－6＿CS、GATA＿consensus、NF－E110个转录因子结合位点。造成－508位原有的转录因子BPC1＿CS结合位点消失（图3）。本研究发现T－508A 突变附近位置发生转录因子结合位点的显著改变，几乎所有软件均预测该SNP位点会导致新的转录因子结合位点产生，该位点虽不处于预测的核心启动子区，但可能通过影响增强子与转录因子结合活性进而调控基因表达。

表2 STAT1基因转录因子结合位点预测结果Table 2 Prediction of transcription factors binding sites of STAT1gene

2.4 STAT1基因RNA 二级结构预测

突变前后STAT1基因的RNA 二级结构预测（图4）结果表明：多态性位点未引起RNA 二级结构最小自由能改变，突变前后均为－9.694×105J／mol。但SNP 位点显著改变RNA 二级结构，从＋78位～＋408范围茎环结构发生明显改变，并在突变后导致＋78位点附近原本较稳定的茎区变为无碱基互补配对的环区，显著影响RNA 二级结构稳定性，可能影响随后转录因子结合及后续转录翻译过程。有趣的是，本研究筛选到的SNP位点均远离RNA 二级结构发生明显改变的范围，说明RNA 二级结构可受远端单碱基突变影响。

图3 TFSEARCH 软件转录因子结合位点预测结果Fig.3 Prediction of transcription factors binding sites by TFSEARCH

图4 STAT1基因RNA 二级结构预测结果Fig.4 RNA secondary structure prediction of STAT1gene

2.5 STAT1基因5＇调控区CpG 岛预测

启动子区CpG 岛通常处于非甲基化状态，可与特异性转录因子结合，但异常甲基化的CpG 岛显著降低与反式作用因子的结合活性，DNA 甲基化可直接干扰特异性转录因子EZF、CREB、APZ等与启动子序列结合抑制基因表达［7］。本研究利用Webgene和MethPrimer等5种生物信息学软件预测目标序列CpG 岛（表3，图5），以GC 含量大于50%，Obs／Exp比值＞0.6和CpG 岛范围大于200bp为判定标准，以转录起始位点为0位，上下游分别以正、负号标明，各软件在目的序列中均预测有CpG岛存在，说明STAT1启动子序列中CpG 岛可能对其功能发挥具有重要作用，本研究发现的SNP位点均处于各软件预测的CpG 岛区，但未对CpG 岛范围造成明显影响，说明本研究所发现SNP 对STAT1基因启动子区甲基化水平影响较小。

表3 不同软件预测STAT1基因启动子区CpG 岛Table 3 Prediction of CpG island of STAT1gene by various software

图5 MethPrimer软件预测CpG 岛结果Fig.5 Prediction of CpG island by MethPrimer software

3 讨论

STAT 蛋白家族共有7 个成员，分别为STAT1－4、STAT5A、STAT5B、STAT6［8］。在GH信号通路中，GH 首先诱导细胞膜受体GHR 二聚体化，进而导致JAK2激酶磷酸化而激活。激活的JAK2使自身及GHR 的酪氨酸残基磷酸化，活化的JAK2和GHR 构成复合物吸引STAT 蛋白等下游蛋白与其高亲和力位点结合，激活的STAT 蛋白形成同源或异源二聚体进入核内作为转录因子诱导相关基因表达［9］。STAT1 激活后可与STAT3 蛋白构成异源二聚体复合物进入核内作为转录因子调控基因表达，Khatib 等［10］通过牛体外受精试验证实STAT1、STAT3基因SNP 位点与牛受精率（fertilization rate）和胚胎存活率（embryonic survival rates）显著相关，STAT1和STAT3优势基因型的交互作用更能提高受精率和胚胎存活率。STAT1蛋白涉及牛乳腺发育，可能与牛产奶性能有关系。

对于牛STAT1基因多态性研究较少，Cobanoglu等将其作为产奶性能候选基因进行多态性分析后，褚敏等［11］进一步发现STAT1基因内含子11存在SNP位点，其BB 为中国荷斯坦奶牛第一、二胎次乳蛋白率的优势基因型，而3＇－UTR 中C 等位基因可促进第一、二胎次产奶量和乳蛋白率。本试验首次针对STAT1 启动子区鉴定SNP 位点，在STAT1基因5＇调控区及第1外显子鉴定得到3个SNP位点，对于2 个生长性能差异明显的牛种，务川黑牛作为贵州地方优良品种，因其良好的生长、肉质性能深受养殖户看重，其生长性能优于荷斯坦奶牛。T－537G 多态性位点在两个牛种中均存在，该突变位点是否造成其生长性能差异需进一步研究。荷斯坦奶牛产奶性能相较务川黑牛更好，贵州荷斯坦奶牛T－508A、C＋10T 两个位点均出现杂合子，而务川黑牛在该位点并不表现多态性，该位点可能对两个品种产奶性能有一定影响，下一步将针对该SNP位点进行功能性验证。

不同软件预测核心启动子和CpG 岛区域有差异，利用多种软件综合分析可最大限度提高预测准确性，本研究所发现C＋10T 位点处于核心启动子区域，并且靠近转录起始位点，可能在调控STAT1基因表达中发挥重要作用，而另两个SNP位点可能作用于其他调控区域而影响基因表达水平。SNP位点突变均导致不同转录因子结合位点消失和产生新结合位点，其中T－537G、T－508A 对其附近的转录因子结合位点影响较大，说明突变位点可直接影响特异转录因子与调控序列的结合，该位点还对STAT1基因二级结构有影响，造成从＋78位～＋408范围茎环结构改变，SNP 位点导致＋78位点附近原本稳定的茎区变为无碱基互补配对的环区，显著影响RNA 二级结构稳定性，而远端C＋10T 对转录因子结合位点无显著影响。DNA 甲基化可显著降低靶基因表达水平，5种生物信息学软件均预测STAT1基因启动子区域具有范围较大的CpG 岛，说明DNA 甲基化水平对STAT1基因表达调控有重要作用，本研究发现的SNP位点均处于各软件预测的CpG 岛区，但未对CpG 岛范围和GC 含量造成明显影响，说明多态性位点通过改变STAT1 基因启动子甲基化水平而调控基因表达的可能性较小。对STAT1基因SNP 研究结果为进一步分析STAT1启动子功能奠定实验基础。

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