Apollon反义核酸促进肝癌HepG2细胞凋亡机制的探讨

2013-01-07黎毓光何金花谢杏仪陈顺仪陈武嘉黄国贤

检验医学 2013年9期

关键词：肝癌

黎毓光，何金花，王莉，谢杏仪，陈顺仪，陈武嘉，黄国贤

(广州市番禺区中心医院检验科，广东广州511400)

凋亡抑制蛋白(inhibitor apoptosis protein，IAP)最早从杆状病毒中分离，此后在酵母、昆虫、人和其他哺乳动物组织中都有发现，是近年来发现的具有抗凋亡作用的蛋白家族。目前共发现IAP 家族中有 XIAP、c-IAP1、c-IAP2、NIAP、Apollon、Livin、Survivin、ILP-2 等 8 个成员［1］。Apollon/BRUCE是IAP家族中最大的蛋白，相对分子质量为530×103，含有4 830个氨基酸，是高尔基体外膜蛋白，具有一个杆状病毒IAP重复序列(BIR)结构域及一个泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme，UBC)结构域。其中BIR结构域位于IAP的氨基端，是其抑制半胱氨酸蛋白酶(Caspase)活性、抗凋亡的重要结构;UBC结构域位于羧基端，能够加强Apollon的抗凋亡作用。Apollon在人体多种恶性肿瘤中高表达［2］。在前期的研究中，我们筛选出的 IAP家族 Survivin、XIAP、Apollon和 Livin反义核酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASO)能抑制人消化系肿瘤细胞增殖并促进凋亡［3］。本研究重在探讨Apollon ASO促进肝癌细胞凋亡及其机制，期望为肝癌的靶向基因治疗提供试验依据。

材料和方法

一、主要试剂

DMEM/F12培养基购自Gibco公司，脂质体LipofectamineTM2000购自 Invitrogen公司，CCK-8(Cell Count Kit-8)试剂购自日本同仁化学研究所。细胞色素C单克隆抗体(cell signaling公司)，RIPA细胞裂解液(上海申能博彩生物科技有限公司)，二辛可酸蛋白测定试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)，鼠抗beta-actin多抗(武汉博士德生物工程有限公司)，电化学发光试剂盒(碧云天生物技术研究所)。

二、ASO

Apollon ASO(序列 5'-AGCCGCAGCCGCCA TCTTCCG-3')、随机序列反义核酸(random oligodeoxynucleotide，RODN，序列 5'-GAGTCGGGA GTCCGATGGCA-3')由北京赛百盛生物工程技术服务有限公司合成，全硫代修饰，聚丙烯凝胶电泳纯化，冻存于-20℃，使用前用无血清的DMEM/F12培养液配制成100 μmol/L的浓度备用。