晁宏图 邓君丽 马一鸣 王 莉

上皮性卵巢癌是妇科恶性程度最高的肿瘤，大多数患者发现时已是晚期，多烯紫杉醇与铂类联合是治疗卵巢癌的金标准，但容易产生耐药。5年生存率并无明显提高，为30%左右。LBH589是一种新型的HDAC（组蛋白去乙酰化酶）抑制剂，本研究探讨LBH589对上皮性卵巢癌OVCAR-3细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

LBH589购自美国Selleck公司，用DMSO配成10 mmol/L备用。RPMI 1640、新生小牛血清为Gibco公司产品，MTT为Sigma产品。β-tubulin购自美国Abcam公司，Caspase-3、PARP、Bax、Bcl-2购自美国Epitomics Irc公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 OVCAR-3购自美国菌种保藏中心（ATCC）（Rockville，MD，USA）。用含10%新生小牛血清、青霉素100 IU/mL、链霉素100 μg/mL的RPMI1640培养液，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，每2～3天换液传代1次。

1.2.2 细胞抑制率的测定 用MTT法检测细胞增殖抑制率，取对数生长期细胞制成单细胞悬液，将2×103个细胞接种于96孔培养板，试验分为阴性对照组和药物试验组，并设未加细胞、只加培养液的空白对照组，每个组设3个复孔，培养24 h后分别加入不同浓度的LBH589继续培养48 h，加入20 μL/孔 MTT（5 mg/mL），37°C孵育4 h后，离心1 000 r/min，10 min，弃上清加入DMSO 150 μL，震荡10 min，至紫色结晶完全溶解，选择560 nm波长，酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度OD值（A值），以空白对照OD值调零，试验重复3次，计算抑制率（%）=1-（试验组A值-空白对照组A值）/（阴性对照组A值-空白对照组A值）×100%。

1.2.3 AO/EB荧光染色 取对数生长期细胞制成单细胞悬液，用5×104个细胞接种于6孔培养板，试验分为阴性对照组和药物试验组，培养24h后加入0.01×nM LBH589继续培养48 h，用2.5 g/L胰酶消化后离心，用PBS洗后离心弃上清，加入100 μL吖啶橙（AO 100 μg/mL）、溴化乙啶（EB 100 μg/mL）混合后滴片，立即用荧光显微镜观察。

1.2.4 Western blot检测 细胞接种和药物浓度与上述相同。处理细胞48 h后提取蛋白质，BCA方法进行蛋白定量，行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶于37℃温箱内封闭纤维素膜30 min，加入一抗处理4℃过夜，第二天与二抗杂交1 h后TBST洗涤3次，用WB成像系统及分析图像软件（ImageQuant LAS4000）发光显像。检测蛋白表达水平。

1.3 统计学方法

应用GraphPad Prism 4.00软件进行one-way ANOVA。

2 结果

2.1 LBH589对OVCAR-3细胞增殖的影响

不同浓度（0～10 μM）LBH589处理OVCAR-3细胞24、48、72 h可明显抑制OVCAR-3细胞增殖，并呈剂量及时间依赖性（图1）。LBH589作用于OVCAR-3细胞48 h半数抑制浓度（IC50）为0.12 μM。同时，倒置显微镜下发现，细胞形态发生改变，发生固缩、碎裂，失去贴壁能力，呈现明显的凋亡特征。

图1 LBH589对OVCAR-3细胞的增殖抑制作用Figure1 Inhibitory effect of LBH589 on the proliferation of the human ovarian cancer cell line OVCAR-3

2.2 AO/EB染色

正常对照细胞主要呈细胞核绿色淡染，胞浆桔黄或桔红色，早期凋亡细胞的细胞膜尚完整，胞浆发生固缩，细胞核固缩或碎裂，呈致密浓染的黄绿色，有的还可见碎块状。晚期凋亡细胞的胞膜通透性增加，EB能够通过，呈鲜红色固缩体或碎块，坏死细胞为鲜红色的膨大细胞（图2）。

图2 AO/EB染色法观察OVCAR-3细胞凋亡的形态学变化Figure2 Morphological changes in apoptotic OVCARr-3 cell observed via AO/EB assay

2.3 LBH589对OVCAR-3细胞相关凋亡蛋白的影响

LBH589作用OVCAR-3细胞48 h后，Caspase-3、PARP-85kD蛋白表达增加，pro-Caspase-3、PARP-115kD蛋白无明显变化，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少，促凋亡指标Bax蛋白表达增多。

图3 LBH589处理OVCAR-3细胞对凋亡蛋白的影响Figure3 Effect of LBH589 treatments on apoptosis-related proteins of the human ovarian cancer cell line OVCAR-3

3 讨论

LBH589是新一代广谱的组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，在多项体外研究证明LBH589能诱导多发性骨髓瘤、甲状腺癌、乳腺癌细胞的凋亡［1-3］。有的已经进入临床试验［4-5］，为了明确LBH589对卵巢癌细胞的抗肿瘤作用，本研究从抑制细胞增殖和促进细胞凋亡两方面观察其对卵巢癌细胞OVCAR-3细胞株的影响。

细胞增殖与细胞周期的运转有密切的关系，调控细胞周期可以影响细胞增殖。细胞周期的调控异常是肿瘤发生的重要机制。本研究用MTT法检测细胞增殖抑制率，发现LBH589抑制了OVCAR-3细胞的增殖，并随着剂量和时间的增加，抑制率增加。LBH589可使细胞周期阻滞于G2/M期［6-7］，LBH589影响细胞周期进程可能涉及多个细胞周期调控相关蛋白，说明LBH589有较广的抗癌靶点。

AO/EB染色法从形态上观察LBH589作用OVCAR-3细胞后凋亡的变化。AO可以透过细胞膜，将细胞核内的DNA染成绿色，胞浆内的RNA呈桔红色。坏死细胞不仅细胞膜不完整，而且线粒体肿胀，为鲜红色的膨大细胞［8］。LBH589处理OVCAR-3细胞后可以观察到此变化，说明LBH589作用OVCAR-3细胞后可以诱导细胞凋亡，且和药物浓度及作用时间呈正相关。

凋亡信号通路缺陷是许多肿瘤组织的特性，并和肿瘤抗药性相关。促进肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤的有效手段。Bcl-2家族是一类调控细胞凋亡的关键蛋白，研究表明，HDAC抑制剂可以通过调控Bcl-2家族蛋白的表达，活化凋亡信号转导通路，进而诱导细胞凋亡［9］。PARP的剪切通常认为是Caspase-3途径激活的标志［10］。通过Western blot检测凋亡通路的关键分子发现，LBH589作用OVCAR-3细胞48 h后底物PARP-85 kD增加，抗凋亡指标Bcl-2蛋白表达减少，促凋亡指标Bax蛋白表达增加。因此，LBH589诱导卵巢癌细胞OVCAR-3发生凋亡的机制主要是通过调控Bcl-2家族蛋白Bax和Bcl-2的表达，激活Caspase-3凋亡通路，进而诱导肿瘤细胞凋亡。

本研究结果表明，LBH589可以明显抑制卵巢癌细胞OVCAR-3的增殖，与剂量及作用时间呈正相关，通过调节Bcl-2家族蛋白的表达，诱导细胞凋亡，具有抗肿瘤作用，为将来的临床试验和应用提供了实验依据。

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