范鸿冰，陈孙福，洪惠，罗永康

1(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京，100083)

2(广西盟展鳄鱼科技开发有限公司，广西南宁，530028)

鳄鱼(crocodile)是一种从中生代至今生长的脊椎类两栖爬行动物，与已灭绝的恐龙是近亲，是最古老的爬行动物，在地球上已生存了2亿3千多万年，具有“活化石”之称［1］。鳄鱼全身都是宝，如鳄鱼肉含有丰富的优良蛋白质和人体必需的氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素和多种微量元素。鳄鱼肝有补脑、生新血、去湿气之功。食用鳄鱼肝可解毒明目，养血益肾，对肝功能欠佳和视力不好者，都具有明显的食疗作用，同时还可以抑制结石的生成［2］。鳄鱼骨可防治风湿骨痛，骨粉含有大量的活性钙及磷等物质，可用于防治老年骨质疏松症、小儿软骨症等［1］。鳄鱼尾胶，不但能滋补肝肾，益气固本，增强细胞活力，而且能护肤养颜，增加皮肤弹性，减少和延缓皱纹的早现，对过敏症也有满意效果［3］。但目前各地对鳄鱼的商业利用多集中在皮革、食用方面，在医疗保健和药用价值的开发利用还比较薄弱，缺乏深入的基础研究，尚未形成规范的产品。目前国内外对鳄鱼的研究较少，关于鳄鱼骨蛋白酶解产物的功能特性及抗氧化性的研究更是鲜有报道。

本试验以养殖鳄鱼鱼骨为原料，采用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶及双酶混合使用对其进行酶解，并测定了酶解产物的功能特性及抗氧化性，为鳄鱼鱼骨的深入研究和进一步广泛应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

鳄鱼鱼骨，由广西盟展鳄鱼科技开发有限公司提供。

碱性蛋白酶，丹麦NOVO公司;木瓜蛋白酶，广西南宁庞博生物工程有限公司;三硝基苯磺酸(TNBS)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、啡咯嗪，美国Sigma公司;其他试剂均为化学分析纯。

UNICO-2007分光光度计，美国Unic公司;DS-1高速组织捣碎机，上海标准模型厂;TGL-16A台式高速冷冻离心机，上海安亭科技仪器厂;FE20梅特勒-托利多实验室pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;FD-1PF冷冻干燥机，北京德天佑科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鳄鱼骨基本组成成分的测定

蛋白质含量的测定:凯氏定氮法(GB5009.5-2010);粗脂肪含量的测定:索氏抽提法(GB/T5009.6-2003);水分含量的测定:直接干燥法(GB5009.3-2010);灰分含量的测定:550℃灼烧法(GB5009.4-2010)。

1.2.2 鳄鱼鱼骨蛋白酶解产物的制备工艺

鳄鱼鱼骨→洗净→剁块→绞碎→高温蒸煮(121℃、20 min)→干燥(105℃、8 h)→二级粉碎→与去离子水混合(质量体积比1∶10(g/mL))→调温度、pH后加蛋白酶酶解(酶与底物质量比3.87 g/kg，木瓜蛋白酶酶解4 h［pH7.0，60℃)、碱性蛋白酶酶解4h(pH8.0，60℃)、双酶(0～1 h内木瓜蛋白酶酶解、灭酶、加入碱性蛋白酶酶解3h)］→灭酶(100℃，10 min)→离心(10 000 r/min，10 min)→取上清液→冷冻干燥→鳄鱼鱼骨蛋白酶解产物

1.2.3 水解度的测定

参考 Alder-Nissen［4］和 Spellman 等［5］的三硝基苯磺酸法(trinitribenzenesulfonic，TNBS)。

1.2.4 抗氧化性的测定

1.2.4.1 亚铁离子螯合能力的测定［6］。

取蛋白质浓度为5 mg/mL酶解产物待测液1.0 mL与3.7 mL 99.5%的无水乙醇及0.10 mL 2×10-3mol/L FeCl2混匀，加入0.20 mL 5×10-3mol/L啡咯嗪启动反应，室温下静置20 min，并于562 nm处测定吸光度。对照组以1 mL去离子水代替酶解产物溶液。亚铁离子螯合能力的计算:

式(1)中:A样品和A对照分别表示样品反应液和对照溶液在562 nm下的吸光度。

1.2.4.2 清除DPPH自由基能力的测定［7］。

取蛋白质浓度为5 mg/mL的酶解产物待测液1.50 mL与1.50 mL浓度为99.5%的无水乙醇混匀，加入0.375 mL 0.02%(质量分数)的DPPH乙醇溶液振荡混匀。室温下暗室反应60 min后在517 nm处检测反应液的吸光度。清除DPPH自由基能力计算公式:

式(2)中:A样品和A对照分别表示样品反应液和对照液在517 nm下测得的吸光度。

1.2.4.3 还原力的测定［8］。

取蛋白质浓度为5 mg/mL酶解产物待测液1.0 mL，加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.6)和2.5 mL 1%(质量分数)的 K3［Fe(CN)6］溶液混匀，50℃水浴20 min后急速冷却，加入2.5 mL10%(质量分数)TCA(三氯乙酸)，充分混匀后3 000 r/min离心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水及0.50 mL 1%(质量分数)的FeCl3充分混匀，室温反应10 min后于700 nm测其吸光值。

1.2.5 功能特性的测定

溶解性:根据李雪等［9］的方法测定。

热稳定性:根据李雪等［9］的方法测定。

乳化性:参考Pearce等［10］的方法测定。

2 结果与分析

2.1 鳄鱼骨基本成分组成

表1 鳄鱼骨基本成分组成(¯X±S)

2.2 水解度

鳄鱼鱼骨蛋白酶解后，不同酶解时间的水解度变化如图1所示。木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶酶解产物均在酶解过程最初的0.5 h内酶解水解度上升较快，而后随酶解时间的延长水解度变化逐渐减小，这与李雪［9，11］等的研究结果类似。碱性蛋白酶酶解产物在酶解0.5 h以后，水解度显著高于木瓜蛋白酶酶解产物的水解度(P＜0.05)。双酶酶解产物水解度在1 h内变化与木瓜蛋白酶酶解产物一致，在1～2 h内碱性蛋白酶作用下，水解度上升较快，而后随酶解时间的延长水解度变化逐渐减小。这可能是由于随着酶解体系中游离氨基酸含量不断增大，蛋白酶的酶解作用逐渐受到抑制，水解度变化逐渐减小。

2.3 抗氧化性

图1 鳄鱼骨蛋白水解过程中水解度随时间的变化

2.3.1 亚铁离子螯合能力

鳄鱼鱼骨蛋白经酶解后，不同酶解时间的酶解物的亚铁螯合能力如图2所示。由图2可知，在0～2 h内碱性蛋白酶酶解产物的亚铁离子螯合能力均显著大于木瓜蛋白酶酶解产物和双酶酶解产物(P＜0.05)。随着酶解时间的延长，双酶酶解产物的亚铁离子螯合能力逐渐增大并最终趋于平稳，在2～4 h内双酶酶解产物和碱性蛋白酶的亚铁离子螯合力则没有显著性差异(P＞0.05)，且二者均显著大于木瓜蛋白酶(P＜0.05)。本试验也表明木瓜蛋白酶及碱性蛋白酶酶解产物均具有增强螯合亚铁离子的能力，采用双酶酶解得到的酶解产物与碱性蛋白酶酶解产物相似，明显优于木瓜蛋白酶酶解产物。

图2 酶解时间对鳄鱼骨酶解物亚铁离子螯合能力的影响

2.3.2 清除DPPH自由基能力

鳄鱼鱼骨蛋白经酶解后，不同酶解时间的酶解物清除DPPH自由基的能力如图3所示。由图3可知随着酶解时间的延长，3种酶解产物的清除DPPH自由基能力较0.25 h都有所下降，在2～4 h内相同酶解时间下，双酶酶解产物清除DPPH自由基能力显著大于木瓜蛋白酶及碱性蛋白酶酶解产物(P＜0.05)。因此，采用双酶酶解较单独使用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶得到的酶解产物具有更好的清除DPPH自由基的能力，同时该实验也表明了木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶酶解产物都具有清除DPPH自由基的能力。

图3 酶解时间对鳄鱼骨酶解物清除自由基能力的影响

2.3.3 还原力

鳄鱼鱼骨蛋白经酶解后，不同酶解时间的酶解物的还原力如图4所示。由图4可知，相同酶解时间下，0～1 h内3种酶解产物的还原力没有显著性差异(P＞0.05)，但随着酶解时间的延长，2～4 h内双酶酶解产物的还原力均大于木瓜蛋白酶及碱性蛋白酶酶解产物(P＜0.05)，而木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶酶解产物则没有明显区别。本试验结果不仅表明了木瓜蛋白酶及碱性蛋白酶酶解产物具有增强还原力的作用，同时也证明了较单一酶酶解而言，双酶酶解得到的酶解产物具有更好的增强还原力的作用。

图4 酶解时间对鳄鱼骨酶解物还原力的影响

2.4 功能特性

2.4.1 溶解性

不同条件下的鳄鱼骨酶解产物的溶解性见表2。可以看出，酶解产物经酶解之后溶解性良好，其中双酶酶解产物在pH 7时的溶解性均大于84.34%，最高达到97.02%，可能是因为双酶酶解使蛋白质大分子电离出更多的亲水基团和离子基团，其数量与蛋白质的水合作用程度有关。相同的酶解条件下的酶解产物，在0.25～4.00 h内pH 7时不同酶解时间下酶解产物的溶解性均大于 pH 4时的溶解性(P＜0.05)，Quaglia等［12］指出，pH 值会影响酶解产物肽段的静电荷数量从而导致溶解性的变化。同时，相同水解度下，在2.00～4.00 h内的双酶酶解产物在pH 4和pH 7下显著大于木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶酶解产物(P＜0.05)。

2.4.2 热稳定性

酶解产物的热稳定性是衡量其是否适于在食品中应用的一个重要指标［11］。不同条件下的鳄鱼骨酶解产物经热处理后的溶解性见表3。可以看出，酶解产物经93℃，10 min热处理之后溶解性略有下降，但热稳定性仍然良好。其中双酶酶解产物在pH 7下热处理后溶解性均大于77.38%。这可能是由于蛋白质经酶解后肽链展开，亲水-疏水平衡得到改善，更易于水分子形成氢键，所以热处理之后分子之间不容易聚集，仍可保持较高的溶解性［13］。

表2 不同条件下鳄鱼骨酶解产物的溶解性

表3 不同条件下鳄鱼骨酶解产物的热稳定性

2.4.3 乳化性

蛋白质的乳化性是指蛋白质能使水油结合在一起，形成稳定的乳状液的性能［14］，乳化活性表征乳化体系分散相的分散程度及相界面的界面比，反映乳化体系维持两相稳定存在的能力。不同酶解时间下的鳄鱼骨酶解产物的乳化性见图5。随着酶解时间的延长，碱性蛋白酶酶解产物的乳化性呈下降趋势。而在0.25～3.00 h内木瓜蛋白酶及双酶酶解产物的乳化性分别在1.0 h和2.0 h达到最大，这可能是因为蛋白质被酶解后，分子内部的疏水残基暴露，蛋白质在油-水界面吸附、扩散能力提高，乳化能力增强。随后其乳化性减小，这可能是由于其酶解产物中小分子的肽和氨基酸增多，不利于蛋白质在油-水界面的扩散和吸附，导致乳化性的下降［15］。相同酶解时间下，双酶酶解2.0 h和3.0 h得到的产物的乳化性显著高于其他组(P＜0.05)。

图5 酶解时间对鳄鱼骨水解产物乳化活性指数指数的影响

3 结论

(1)鳄鱼鱼骨蛋白酶解产物的抗氧化性受酶解时间及蛋白酶种类的影响，采用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶双酶酶解产物的抗氧化性较强，具有作为天然抗氧化剂的潜力。

(2)采用此种双酶酶解法酶解鳄鱼骨，在温度60℃和pH7.0条件下，按酶底物比3.87 g/kg加入木瓜蛋白酶酶解1 h后，100℃灭酶10 min，于60℃调节pH8.0后加入碱性蛋白酶酶解1h得到的酶解产物具有较好的抗氧化性和功能性质，可以考虑取该条件下的酶解产物制备抗氧化剂应用于食品工业。

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