刘莉，赵建伟，焦爱权，田耀旗，周星，徐学明，金征宇

1(江南大学食品学院，江苏无锡，214122)

2(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡，214122)

随着经济的发展、生活节奏的加快，方便食品越来越受到人们的青睐［1］。方便米饭是一种新兴食品，不仅满足即食方便的要求，而且作为一种主食产品，弥补其他方便食品营养单一的不足。方便米饭营养丰富符合现代人的消费理念，具有广阔的发展前景，但其在存储过程中硬度增加，黏度降低，从而使口感变差和消化性降低。因此抑制回生是改善方便米饭品质，延长货架期的首要因素。

回生问题可通过采取各种有效措施来延缓，但不能完全抑制。相关文献报道［2-6］多集中于物理抗性修饰，即添加抗淀粉回生的食品添加剂，如低聚糖、亲水性胶体和乳化剂等。低聚糖β-环糊精(β-CD)分子尺寸小，易溶于水，在淀粉糊化过程中，可随着水分渗透进入淀粉颗粒的内部，与淀粉分子相互作用。在淀粉短期回生过程中，β-CD外壁亲水性羟基与直链淀粉α-单螺旋外层羟基以氢键作用力结合形成络合物，抑制游离的直链淀粉快速渗透于支链淀粉结晶区而有序重排，起到回生延缓作用［3］。在通常蒸煮条件下，抑制回生的添加剂难以渗透到大米颗粒内部，渗透效果程度较低，抗回生效果并不理想。

荧光示踪法是添加便于追踪的色素或荧光物质来观察、研究和阐明某物质在指定过程中的行为或性质的一种标记方法。荧光示踪技术的关键是制备荧光标记聚合物。通过采用电脑多媒体技术配合荧光显微镜，建立了荧光示踪系统，对样本进行连续逐层扫描，得到细胞或组织内部细微结构的荧光图像［7-8］。

本文采用在大米浸泡液中添加β-CD，并用超高压处理以期减少米饭回生程度。本文用高效液相色谱法(HPLC)定量检测大米浸泡液中β-CD的残留量和用示踪法来跟踪β-CD渗入温水浸泡米粒中的分布情况。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂与仪器

粳米(福临门响水香米)，市购，水分含量为15.31%(w.b.)，购回后储藏在4℃的冰箱中。

β-CD，上海西宝生物科技有限公司;β-CD标样，Sigma-Aldrich公司;葡萄糖淀粉酶，无锡杰能科生物有效公司;猪胰 α-淀粉酶，sigma公司;1，8-二羟基蒽醌，上海晶纯试剂有限公司;OCT(opti-mum cutting temperature)包埋剂，上海西塘生物公司;其他所有试剂均为分析纯。

蒸汽蒸煮器，由小型灭菌锅改造;立式蒸煮袋，市购;超高压设备(HP800Mpa/3L)，包头科发高压科技有限公司;高效液相色谱仪(Water 600)，美国water公司;NH2柱，美国Thermo公司;红外光谱仪(NICOLET NEXUS 470)，美国Thermo公司;激光共聚焦显微镜(LSM 710)，德国Lavision Biotec;柜式冰冻切片机(Micron HM560)，上海倍曼生物有限公司。

1.2 方法

本研究在米粒浸泡液中添加β-CD/包合物，并用不同压强处理浸泡液。一方面因大米颗粒成分复杂，直接测定渗入的β-CD不易，故采用间接的方法用HPLC测定米粒浸泡液中β-CD含量;另一方面选择适宜的荧光分子与 β-CD包埋来示踪 β-CD在500MPa下向大米颗粒内部的渗入分布情况。本实验方法流程图如图1:

图1 实验方法流程图

1.2.1 制备残留β-CD的大米浸泡液

实验目的是制备在常压和超高压压强下添加2%的β-CD的大米悬浮液中含残留β-CD的浸泡液。将1 g β-CD溶于75 mL超纯水，加大米50 g，到立式铝箔食品袋后真空封装。然后在常压60℃的浸泡30 min，然后四组样品分别在0，100，300和500 MPa(温度为40℃)下浸泡20 min，收集各组的浸泡液。

将4组的浸泡液分别倒入标有记号的锥形瓶中，然后4次用50 mL的超纯水冲洗米粒表面上残留的浸泡液一并收集到对应的锥形瓶中。在浸泡液中加入1 000 u/mL的葡萄糖淀粉化酶3 μL，在37℃的恒温振荡水槽中振荡3 h。随后，各组浸泡液定容到350 mL，在100℃下电磁搅拌10 min，5 000 r/min离心15min，收集各组浸泡液的上清液，进行高效液相色谱(HPLC)定量检测样品中β-CD的含量。

1.2.2 高效液相色谱法(HPLC)测定β-CD的含量

液相是Waters 600，使用氨基柱，示差折光检测器，流动相是 V(乙腈)∶V(水)=70∶30，柱温 30℃，流速 1 mL/min，进样量 10 μL。

取大米浸泡的上清液10 mL样品经微孔过滤器过滤(孔径0.45 μm)，进 HPLC分离，得到流出峰。依据标样的峰面积计算大米浸泡液中β-CD含量。

β-环糊精标准样品配制:精密称量β-环糊精标样10.00 mg，置10.0 mL量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成1 mg/mL浓度的溶液，作为标准液。

1.2.3 固体包合物的制备和表征

将充分干燥的约4 g的β-CD溶于约70～80℃的500 mL热水中，待β-CD全部溶解后加入约0.8 g的1，8-二羟基蒽醌，于50℃下搅拌12 h，逐步降温，待析出黄色晶体后减压过滤，用温水洗涤干燥，所得产物为 β-CD 与 1，8-二羟基蒽醌的包合物［7-8］。在相同条件下分别做1，8-二羟基蒽醌、β-CD、β-CD 与1，8-二羟基蒽醌混合物、β-CD 与 1，8-二羟基蒽醌包合物的红外光谱。制样方法:KBr压片法;扫描次数32次分辨率4 cm-1。同时做2% β-CD与1，8-二羟基蒽醌包合物溶液的差示扫描量热谱，温度扫描20-100℃，升温速率5℃/min。

1.2.4 激光共聚焦显微镜扫描观察

将5 g大米于立式铝箔小蒸煮袋中，在7.5 mL大米浸泡液中添加2%的包合物，在60℃的温水中浸泡30 min。超高压样品在500 MPa，40℃的超高压条件下浸泡20 min。因米粒冰冻切片易破碎保持不完整性，所以将米饭继续进行蒸煮软化。米粒放在立式蒸熟袋中封装，在沸水浴中蒸煮7 min，焖饭10 min，冷却至室温。将常压处理和超高压处理的米饭进行OCT包埋后放置在-18℃冷冻约3 h。在-30℃下冰冻切片，切片厚度为30 μm。各组样品在相同的条件下用激光共聚焦扫描观察。

激光共聚焦扫描条件为扫描模式:平行;物镜:Zeiss EC Plan Neofluar 20X/0.50 M27;分光镜:MBS488/543(MBS_InVis:plate FW1:NonelLSW);激光:543 nm;像素停留时间:2.33 μs;滤光器:554～697;X 轴缩放:1.661 μm;Y 轴缩放:1.661 μm。对切片小区域逐一扫描，然后自动拼成米饭切片完整的荧光图像。

2 结果与讨论

2.1 高效液相法(HPLC)测定米粒浸泡液中的β-CD含量

在设定的分析条件下，对1 mg/mL的β-CD的标样和分别在0、100、300和500 MPa(温度40℃，时间20 min)的米粒浸泡液进行分离定量测定。试验结果如图2所示，β-CD在保留时间11.00 min处开始出峰，β-CD的含量在常压对照组中最高，不同压强条件下β-CD的含量存在显著性差异。可以看到，随着处理压强的增大，浸泡液中残留的β-CD含量减少，则进入米粒中的β-CD逐渐增多。在所有样品的浸泡液中都添加了2%的β-CD即1.0 g，常压对照组浸泡液在常压下残留量为0.86 g，说明用4次超纯水冲洗浸泡米粒后，米粒表面吸附有少量的β-CD或进入米粒颗粒。在500 MPa处理下，浸泡液中的β-CD含量显著减少，仅为0.424 g。较之常压对照组，在500 MPa下浸泡处理的米粒多渗入了约0.436g β-CD。渗入米粒的β-CD的含量随超高压压强增加而增多。通过HPLC法定量测定不同压强下浸泡液中的β-CD的分析结果可看出，β-CD在超高压条件下可以渗入60℃温水预浸泡的米粒内部。

图2 β-环糊精标准品和不同压强下处理大米浸泡液的高效液相色谱图

表1 常压下和不同压强下浸泡液中残留的β-环糊精含量

2.2 包合物鉴定和表征

图3 β-CD和1，8-二羟基蒽醌的红外吸收光谱图

比较图3中各红外吸收图谱发现，β-CD和1，8-二羟基蒽醌的的红外吸收图谱有明显差别。在1 600 cm-1附近的苯环骨架振动和1670 cm-1附近的C=O伸缩振动可以明显地看到1，8-二羟基蒽醌的特征峰。对照于β-CD，包合物图谱中临近C=O的CH3在1 370 cm-1有中等强度的吸收峰(对称弯曲振动)，说明有新物质的介入使其出现新峰。包合物较之于物理混合物，1，8-二羟基蒽醌的许多吸收峰被掩盖，并且在1 670 cm-1附近的C=O伸缩振动的吸收峰有所增强，说明有新物质产生，可能是因为β-CD包合1，8-二羟基蒽醌，使1，8-二羟基蒽醌的构象发生变化。

2.3 包合物溶液热学性质

从图4可看出β-CD-1，8-二羟基蒽醌包合物曲线出现一个吸热峰，在66.87℃ -80℃处为包合物的分解吸热带。在水分子竞争作用下，随着温度的增大，β-CD与1，8-二羟基蒽醌间的氢键作用力越来越弱，而与水分子间的作用力越来越强。包合物从66.87℃开始慢慢解体，最后在80℃处分解大致完成。1，8-二羟基蒽醌不溶于水，包合物易溶于水，且荧光强度增加［8］。包合物添加到浸泡液中，在低于66.87℃下，温水浸泡和超高压浸泡处理中包合物都不容易发生分解。在蒸汽蒸煮过程中，即使包合物发生可逆反应释放1，8-二羟基蒽醌，由于不溶于水不易进入米粒而对实验造成干扰。米饭内部已进入的包合物部分发生分解释放出1，8-二羟基蒽醌，同样也具有荧光性，对米饭切片显微镜观察亦不造成影响。所以从DSC图，可以看β-CD-1，8-二羟基蒽醌包合物可以作为超高压处理过程中β-CD渗入的示踪剂，用来示踪β-CD在超高压处理中的渗入分布情况。

图4 2%β-CD与1，8-二羟基蒽醌的包合物溶液的差示扫描量热图

2.4 激光共聚焦显微镜观察

图5 为在常压和超高压不同浸泡条件下的米饭横截面切片扫描图。

图5 A，B为常压处理的米饭切片C，D和E为超高压500 MPa浸泡处理的米饭切片(白色箭头所示为米饭内部的缝隙)

从图5中可以看出，米饭切片的内部有若干条黑色的细长条，推测为米饭颗粒内的缝隙。在切片过程中冰冻刀片切割力的作用使得米粒内缝隙有进一步增大的可能。米饭切片的边缘若干处有强荧光性，说明米饭在荧光包合物溶液中浸泡残留了一些荧光物质在米饭表面。从图5观察到，从米饭切片的外围部分到中心处，荧光强度并非由强依次减弱。这说明包合物在超高压处理下进入到米粒内部的渗透不局限于通过扩散运动而停滞在米粒表面外部。为了进一步探讨米粒间的缝隙是否存在，即考察包合物进入米饭的途径，用猪胰α-淀粉酶溶液来水解米饭。实验发现淀粉酶并不是一圈一圈地水解米饭，米饭表层各部分水解程度不一样，凹凸不平，甚至有些米饭被水解地支离破碎(图6)。说明米粒内的缝隙是存在的，缝隙是从米粒表面通向米粒内部，淀粉酶正是通过这些裂缝渗透，不断地水解大米淀粉分子。

谷物中淀粉颗粒的形态结构、谷物颗粒间的裂纹分布和硬度分布决定了水渗透的路径和速度。Horigane［9］等通过三维加权梯度回波磁共振成像技术监测米粒浸泡过程中水分的渗透路径。研究日本普遍食用的Koshihikari米粒浸泡时，水分子首先穿透米粒的腹侧表面和胚芽附着位点，然后沿着胚乳中央线和横向裂纹迁移，最终扩散到胚乳的其它部分。带白点的Yamadanishiki大米在浸泡时，除了在最开始时水分快速渗透进裂缝处或背腹边的白垩部分，水渗透的位点和水分扩散模型跟前者是相似的。因此无论是普通米粒还是带白点有胚芽的米粒，米粒内部的裂缝处和中央部分存在一个非常松散的结构、空腔或裂纹，可以允许更多的水渗透保留。水分渗透主要是通过米粒表面到内部的缝隙、胚乳部分的中央线和横向裂纹扩散到米粒胚乳其他部分。

图6 淀粉酶水解米饭前后对照图

超高压处理的米饭切片中间部分的荧光强度明显高于常压处理米饭，且荧光物质多集中于米粒切片内部缝隙的淀粉大颗粒附近。实验表明超高压处理大大加强了包合物向米粒内部的渗透作用。Ahrmrit等［10］通过大量实验统计发现超高压处理可促进浸泡大米的水分渗透，并且水分渗入量与超高压压强、温度和时间条件成正相关。同时超高压进一步破坏米粒的硬质纤维［11］，有利于包合物充分进入米粒内部。β-CD包合物分子尺寸小，易溶于水，在超高压外力强制渗透浸泡及淀粉糊化过程中，可随着水分渗透沿着米粒表面处的裂纹、胚乳中央线和横向裂纹迁移，最终扩散到胚乳的所有部分。随着淀粉糊化进行，淀粉颗粒内结晶区域则由原来排列紧密有序的状态变为疏松杂乱状态，包合物与淀粉分子相互作用。从以上的分析可知，β-CD可通过超高压处理充分渗透到米粒内部，从而使得有效抑制大米淀粉的回生成为可能。

3 结论

(1)通过HPLC液相法定量检测常压和不同超高压压强处理下米粒浸泡液中残留β-CD含量，实验结果表明随着压强的增大，浸泡液中β-CD的残留量减少，从而说明β-CD超高压浸泡处理能有效促进β-CD到米粒内部。

(2)β-CD来包埋1，8-二羟基蒽醌制备成的包合物具有强荧光性，可示踪β-CD在超高压条件下的渗入情况，对照常压浸泡的米饭切片可看出，超高压浸泡米饭切片内部荧光强度强于未处理米粒，说明超高压处理确实能有效渗透β-CD米饭内部。

(3)超高压浸泡米饭切片的荧光物质主要集中在米饭中间部分的缝隙处，在米饭内部分布较为均匀，具有强荧光性。

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