张美玲，赵新淮

(东北农业大学，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨，150030)

天然蛋白质没有展示出食品工业所需要的性质，经过特定的修饰会改变其相应性质［1］，酶水解通常被用来提高蛋白质的功能性及营养性［2］。来自植物或者动物蛋白的活性肽除了能作为正常营养品，还具有调节功效［3］。大豆蛋白是潜在的活性肽的来源，研究表明，大豆肽展示了许多生物活性:如降血压性，抗氧化性等［4］。Decker证实一些肽段在螯合过度金属离子(亚铁离子和铜离子)方面有重要作用，提高矿物质的生物利用率，有助于促进身体健康［5］。

类蛋白反应是蛋白质经过酶水解后，发生缩合作用和转肽作用，会产生原水解物中不存在的新肽段，就有可能改变其生物活性［6］。之前的研究表明，水相中类蛋白反应能提高大豆蛋白水解物的功能性［7］，但在别的介质中是否产生同样的效应尚不清楚。为此，本研究利用类蛋白反应在乙醇-水相中对大豆蛋白水解物进行酶法修饰，采用响应面法优化修饰条件合成其他产物，评价和比较修饰产物的金属离子螯合能力。

1 材料与设备

1.1 主要材料

脱脂大豆蛋白粉，哈尔滨高科技蛋白有限公司;Alcalase 2.4L FG，诺维信生物技术有限公司，酶活力110 kU/g;3-(2-吡啶基)-5，6-双(4-苯磺酸)-1，2，4-三嗪(Ferrozine)，Sigma公司。其它所用试剂均为分析纯试剂，所用水为超纯水或蒸馏水。

1.2 主要设备

UV-2401PC型紫外可见分光光度计;AL204型分析天平;G1-21M型冷冻离心机;LGJ-1型空冷冻干燥机;HZQ-F160型全温振荡培养箱;DELTA 320型精密pH计;H-1型微型漩涡混合器;YH-4BS型远红外恒温干燥箱;DK-98-1型电热恒温水浴锅。

2 方法

2.1 大豆分离蛋白的制备

参照文献［6］并略作修改。采用凯氏定氮法确定其蛋白质含量约为92.1%。

2.2 大豆蛋白水解物的制备

配置浓度为8%(m/V)的大豆分离蛋白溶液，调节pH值至8.0，加入碱性蛋白酶(1 kU/g蛋白质)，55℃恒温水浴中进行酶解。于不同酶解时间(0.5～7 h)取出样品20 mL，迅速在95℃沸水浴中加热15 min，冷却至室温后10 000 r/min离心20 min，分离出上清液;测定上清液水解度、亚铁和钙离子螯合能力。根据测定结果，确定适宜的水解时间，放大实验，冷冻干燥后保存于-20℃备用。

2.3 醇-水介质中大豆蛋白水解物的类蛋白反应条件优化

采用Alcalase催化类蛋白反应，根据高博等［5］的研究，采用中心组合试验，固定底物浓度为30%(m/V)，反应温度4 h，以反应产物的游离氨基减少量为响应值，分别研究酶添加量、乙醇体积分数、反应温度的影响，采用3因素5水平响应面方法分析，其因素水平编码见表1。

表1 响应面分析的因素水平编码表

应用上述响应面优化出来的条件，分别制备反应时间为1～8 h的类蛋白反应修饰产物，以大豆蛋白水解物和大豆分离蛋白为对照，测定其金属离子鳌合能力。

2.4 相关分析

2.4.1 酶活力、蛋白质含量、游离氨基含量与蛋白质水解度测定

(1)蛋白酶活力测定:采用福林酚法［8］。

(2)蛋白质含量测定:采用凯氏定氮法［9］。

(3)游离氨基含量水解度(DH)测定:采用邻苯二甲醛法［10-11］。计算公式［12］为:

式中:0.35 mmol/g为大豆分离蛋白的游离氨基含量。

2.4.2 亚铁和钙离子螯合能力测定

采用Xu等［13］方法测定亚铁离子螯合能力，稍有改动。取250 μL 1mg/mL的样品溶液(样品最终浓度为 100 μg/mL)直接与 150 μL 0.5 mmol/L FeCl2溶液混合(最终浓度为30 μmol/L)，加入一定量超纯水，使反应体系终体积为1.5 mL。混匀后，放置2 min，再加入 1mL 500 μmol/L 的 Ferrozine水溶液(Ferrozine终浓度为 200 μmol/L)，充分振荡、混匀。混合体系在室温下静置10 min，紫外分光光度法562 nm下测吸光值。EDTA溶液(终浓度为10 μmol/L)为对照样。亚铁离子的螯合率:

式中:AT，样品吸光度;AC，空白吸光度［X μL 0.5 mmol/L FeCl2溶液加入(1 500-X)μL超纯水］。

采用杨云裳等［14］方法定钙离子螯合能力，略有改动。

绘制钙离子标准曲线。准确吸取0.5%铬黑T-聚乙二醇乙醇溶液0.1 mL于25 mL比色管中，取2 mL pH 10氯化铵-氨水缓冲溶液加入比色管中，再加入1 mL(0、40、80、120、160 和200 μg/mL)钙离子的水溶液，室温放置20 min，然后在510 nm波长处测定吸光值。

在25 mL的圆底烧瓶中加入0.2 mol/L CaCl2-乙醇溶液2 mL，缓慢滴加溶有1%修饰产物的50%的乙醇溶液10 mL，在室温下，搅拌反应1 h，离心分离，收集上清液。将上清液稀释10倍，按照上述方法测定剩余钙的吸光度值。样品对钙离子的螯合率:

式中:A，加入的钙离子浓度(mg/mL);B，剩余的钙离子浓度(mg/mL)。

2.5 数据的统计分析

采用SPASS17.0软件和Design Expert7.0软件对数据进行处理和分析。

3 结果与分析

3.1 大豆蛋白水解物的制备

碱性蛋白酶对大豆分离蛋白进行水解时，水解产物因水解时间不同而肽分子组成不同，其金属离子螯合能力不同。EDTA以及不同水解时间的大豆分离蛋白水解物对亚铁和钙离子螯合能力如表2。

表2 水解时间对大豆分离蛋白水解物的水解度以及亚铁和钙离子鳌合能力的影响

数据显示，大豆蛋白水解物对亚铁离子和钙离子的鳌合能力随水解度的增大而增大;但是，水解4 h后水解产物的水解度变化不显著，且鳌合能力提升的幅度不大。产生这种情况的结果可能是，由于水解物中的肽段的长度及结构不同而影响其对离子的螯合作用［15］。有研究发现，花生蛋白水解物水解度同，其金属离子螯合能力不同［1］。因此，制备水解反应为4 h、水解度为14%的大豆蛋白水解物，作为类蛋白反应的底物。

3.2 类蛋白反应条件的优化

类蛋白反应优化的实验结果见响应面曲面图(图1)。通过软件分析，表明影响响应值的各因素主次顺序为乙醇体积分数、反应温度、酶添加量。反应温度和乙醇体积分数二者之间相互作用对游离氨基含量变化影响较大(P＜0.05)。反应温度和酶添加量二者之间的相互作用较小(P＞0.05)。乙醇体积分数和酶添加量二者之间相互作用比较小(P＞0.05)。乙醇体积分数对类蛋白反应的影响最显著(P＜0.01)，可能是由于乙醇的加入降低了体系的水活度而导致的。水分活度影响类蛋白反应产物的形成，低水分活度能抑制酶的水解，使反应向合成方向进行［16］。反应温度对类蛋白反应也有影响，游离氨基减少量随反应温度的增加而减少，表明反应温度增加使得反应向水解的方向进行。有研究表明，类蛋白反应是放热反应，故较低温有利于反应的进行［17］。

图1 大豆蛋白水解物的乙醇-水介质中类蛋白反应试验结果

综合分析得到大豆蛋白水解物类蛋白反应修饰的适宜条件为:乙醇体积分数为56.8%，反应温度为33.1℃;酶添加量为5.26 kU/g蛋白质。反应产物的游离氨基减少量理论值为129.4 μmol/g蛋白质，实际值为129.3 μmol/g蛋白质(平行3次)，与理论值差异不大，得到的条件参数可靠。

3.3 修饰产物的金属离子螯合能力

利用前述条件，在反应时间分别为1-8 h下制备出反应程度不同的8个修饰产物(MPP 1-8)。另外，用甲醇替代乙醇，分别制备反应程度不同的8个修饰产物(MPP 9-16)。这16个产物的游离氨基减少量、以及对亚铁和钙离子螯合能力见表3。

表3 类蛋白反应修饰产物的亚铁和钙离子鳌合能力

通过表2、表3中的数据比较可知，MPP 1-16对亚铁离子螯合能力比大豆蛋白水解物的更强，对钙离子鳌合能力也显示出类似规律。MPP 1-16的亚铁离子与钙离子螯合能力，随类蛋白反应程度的增大(反应时间1～4 h)先呈现增强趋势，随着反应程度的继续增大(反应时间5～8 h)，螯合能力则呈现下降趋势。类蛋白反应是一种转肽和聚合作用，在反应过程中会形成新的肽段，从而使得MPP 1-16的亚铁离子与钙离子螯合能力有一定程度的提高;随着反应程度的提高，将原有的活性位点破坏，反而导致螯合能力下降。所以，MPP 1-16对2个离子螯合能力与反应程度有关。

由表3数据还可以看出，MPP 1-8(乙醇-水介质中的修饰产物)的亚铁离子与钙离子螯合能力，低于MPP 9-16(甲醇-水介质中的修饰产物)。可能是由于水分活度能强烈影响酶的活力以及反应程度;水分活度越大，酶的活力越大，反应程度也随之越大［18］。相同醇体积分数时，乙醇-水介质的水分活度大于甲醇-水介质。因此，MPP 1-8反应程度大于MPP 9-16，相应的，对2个离子的螯合能力低一些。

蛋白质对钙离子和亚铁离子的螯合能力越强，越能够提高元素的生物利用率，越有利于机体对矿物质元素的吸收利用率［19］。过渡金属如亚铁离子和铜离子能够促进脂肪氧化;蛋白质等对它们的螯合作用，有助于降低氧化速度，减缓食品的腐败［4］。蛋白质水解物的类蛋白反应修饰，可以提高修饰产物对亚铁和钙离子的螯合能力，显示出了此反应对于改善蛋白质水解物的功能性质。

4 结论

(1)碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白，在55℃、底物浓度8%(w/v)、pH值8.0、酶添加量5.26 kU/g蛋白质的条件下水解4 h，可以得到水解度为14.1%大豆蛋白水解物，它对亚铁离子与钙离子螯合能力分别为39.8%和62.1%，高于大豆分离蛋白。

(2)通过碱性酶催化的类蛋白反应，底物浓度为30%、反应时间为4 h下，响应面优化出乙醇-水介质中的适宜反应条件为:酶添加量5.26 kU/g蛋白质、乙醇体积分数56.8%、温度33.1℃;对反应影响的主次顺序为乙醇体积分数、反应温度、酶添加量。

(3)应用响应面优化出的适宜条件，在乙醇-水、甲醇-水体系中，反应时间分别为1～8 h，制备出的16个修饰产物，其对亚铁和钙离子的螯合能力高于大豆蛋白水解物，表明类蛋白反应修饰可以提高产物的金属离子螯合能力。

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