陈血建，兰全学，严琼英，杨俊，陈晶，叶秀玲，杨国武

(深圳市计量质量检测研究院，广东深圳，518131)

蔬菜是人们日常饮食中必不可少的，它为人体提供必需的多种维生素、矿物质和纤维素，同时，蔬菜也容易富集硝酸盐。据报道，人体摄入的硝酸盐有81.2%来自蔬菜［1］，蔬菜经不正确的放置和处理后，其中的硝酸盐会在微生物的作用下被还原成亚硝酸盐［2］，亚硝酸盐通过与血红蛋白反应导致人体缺氧、与次级胺结合则可诱发癌症。据报道，自然界能还原硝酸盐的细菌有百余种［3］，了解这些细菌的特性，对于我们正确存放和处理蔬菜，减少亚硝酸盐的摄入具有指导意义。

笔者在对餐饮企业食品的亚硝酸盐项目监测中，分离得到1株栖冷克吕沃尔菌，本文对该菌的生理生化特性以及该菌在还原硝酸盐及在姜蓉亚硝酸盐产生中发挥的作用进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

栖冷克吕沃尔菌，从深圳市某餐饮企业提供的一份沙拉原料即用嫩姜姜蓉(亚硝酸盐含量160 mg/kg，以N计)中分离得到。

血琼脂平板，郑州安图绿科生物工程有限公司;营养肉汤、平板计数琼脂(PCA)，北京陆桥技术有限责任公司;硝酸盐和亚硝酸盐快速测定试剂条(反应垫上为固体格利斯试剂对氨基苯磺酰胺和N-1萘基乙二胺)，美国Industrial Test Systems公司;Vitek2 GN鉴定卡，法国生物梅里埃公司。

VITEK2 Compact全自动微生物鉴定仪，法国生物梅里埃公司;SHP-250生化培养箱，中国上海精宏实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 栖冷克吕沃尔菌的来源

以1份亚硝酸盐含量为160 mg/kg(以N计)的仔姜姜蓉为材料，涂布血琼脂平板和PCA平板，在37℃下分别置于需氧、微需氧、厌氧条件培养3～6 d，从两种平板中挑取菌落形态占优势的菌株进行纯化培养和生化鉴定，获得栖冷克吕沃尔菌。

1.2.2 栖冷克吕沃尔菌的生理生化特性分析

对栖冷克吕沃尔菌革兰氏染色，并用全自动微生物鉴定仪VITEK 2 Compact进行生化鉴定。同时，将该菌株接种于硝酸盐肉汤生化管中，37℃培养24 h，加入硝酸盐还原甲、乙液，观察颜色变化，检测该菌能否还原硝酸盐。

1.2.3 栖冷克吕沃尔菌在不同冷藏温度的生长特性

将浓度分别为102、104、106CFU/mL的栖冷克吕沃尔菌营养肉汤(pH 7.0、NaCl浓度为0.5%)分别置于1℃、4℃、8℃条件下培养，每日采用倾注平板法测定菌悬液细菌浓度。

1.2.4 栖冷克吕沃尔菌在不同盐浓度的生长特性

配制NaCl浓度为0.5%、1%、2%、5%的营养肉汤(pH 7.0)，分别加入栖冷克吕沃尔菌，使菌悬液浓度为102CFU/mL，置于8℃培养，每日采用倾注平板法测定菌悬液细菌浓度。

1.2.5 栖冷克吕沃尔菌在不同pH值的生长特性

配制 pH 4.0、5.0、6.0、7.0 的营养肉汤(NaCl浓度为0.5%)，分别加入栖冷克吕沃尔菌，使菌悬液浓度为102CFU/mL，置于8℃培养，每日采用倾注平板法测定菌悬液细菌浓度。

1.2.6 栖冷克吕沃尔菌模拟污染试验

将8个不同产地的仔姜品种机械粉碎制成姜蓉，100℃蒸汽处理30 min，污染栖冷克吕沃尔菌，使姜蓉的细菌浓度数量级为105CFU/g，置于8℃培养，每日监测姜蓉中亚硝酸盐含量和细菌浓度。各品种均设置不加细菌的空白对照。

2 结果与分析

2.1 栖冷克吕沃尔菌的生理生化特性

栖冷克吕沃尔菌在血琼脂平板和PCA平板上均形成圆形、光滑、湿润的白色菌落，菌落直径约1～2 mm，无溶血现象。革兰氏染色呈阴性杆菌，多单个散在，无芽孢，菌体大小为(0.5～0.7)μm×(2～3)μm。全自动微生物鉴定仪VITEK 2 Compact生化鉴定结果见表1。该菌为兼性厌氧菌，可使硝酸盐肉汤颜色变为红色，能还原硝酸盐。

表1 栖冷克吕沃尔菌生化鉴定结果

2.2 栖冷克吕沃尔菌在不同冷藏温度的生长特性

由图1～图 3可见，初始浓度为 102、104、106CFU/mL的栖冷克吕沃尔菌营养肉汤，在1℃培养时，未见明显生长，12d内细菌浓度变化甚小;在4℃培养时，102、104CFU/mL浓度的栖冷克吕沃尔菌开始出现缓慢生长现象，达到107CFU/mL浓度所需要的时间分别为22d、11d;106CFU/mL浓度的栖冷克吕沃尔菌生长迅速，达到107CFU/mL浓度所需要的时间为2d;在8℃培养时，3种初始浓度的栖冷克吕沃尔菌达到108CFU/mL浓度仅需要7 d、4 d、2 d。

2.3 栖冷克吕沃尔菌在不同盐浓度的生长特性

图1 栖冷克吕沃尔菌生长试验结果(1℃)

由图4可见，当NaCl浓度为0.5%、1%、2%时，栖冷克吕沃尔菌缓慢生长，在培养7～9d后浓度可升高至107CFU/mL，最高可达到108CFU/mL;当NaCl浓度为5%时，该菌会逐渐死亡，在培养4d后全部死亡。

图2 栖冷克吕沃尔菌生长试验结果(4℃)

图3 栖冷克吕沃尔菌生长试验结果(8℃)

图4 栖冷克吕沃尔菌在不同盐浓度的生长试验结果(8℃)

2.4 栖冷克吕沃尔菌在不同pH值的生长特性

由图5可见，在pH4.0条件下，栖冷克吕沃尔菌呈逐渐死亡趋势，在培养13d后全部死亡;在pH5.0、6.0、7.0条件下，菌株缓慢生长，在培养的第5～6d菌液浓度可达到107CFU/mL。

图5 栖冷克吕沃尔菌在不同pH环境下的生长试验结果(8℃)

2.5 栖冷克吕沃尔菌模拟污染试验

由表2、表3可见，8个品种姜蓉在污染栖冷克吕沃尔菌后，3个品种姜蓉在第4天开始检出亚硝酸盐，4个品种姜蓉在第5天开始检出亚硝酸盐，广东大姜检出亚硝酸盐的时间相对较迟，在第8天才检出;其中红芽姜的亚硝酸盐含量在第7天高达160 mg/kg(以N计)。各品种姜蓉所达到的亚硝酸盐峰值与其本身的硝酸盐含量不成正相关。

测定亚硝酸盐含量的同时监测8个品种姜蓉中栖冷克吕沃尔菌的菌落数量变化。由表2、表4可见，多数姜蓉在细菌浓度达到107CFU/g时开始检出亚硝酸盐，在细菌浓度达到108CFU/g时，亚硝酸盐含量达到峰值。8个未加细菌的对照姜蓉在12 d内均未检出亚硝酸盐。

表2 不同姜蓉的亚硝酸盐浓度随时间变化结果(8℃)

表3 不同姜蓉初始硝酸盐含量和亚硝盐峰值

3 结论与讨论

本文分析了从1份亚硝酸盐含量较高的姜蓉中分离的1株栖冷克吕沃尔菌。克吕沃尔菌是1981年独立成属的肠杆菌科细菌，存在于食物、土壤和污水中［4-5］。目前，国内外只有极少量的关于克吕沃尔菌引起临床感染病例的报道，未见到栖冷克吕沃尔菌引起蔬菜中亚硝酸盐大量积聚的报道［4-8］。本文研究表明，该菌能还原硝酸盐，在4～8℃可大量生长繁殖，适宜生长的 NaCl浓度为0.5% ～2%，pH值为5.0～7.0，模拟污染试验证实，该菌可以把姜蓉中的硝酸盐还原成亚硝酸盐。污染了栖冷克吕沃尔菌的各品种姜蓉，最初亚硝酸盐含量极低，经过一段时间后缓慢上升，随菌株的大量繁殖而迅速达到峰值，然后呈现缓慢下降趋势，这一现象与其他文献报道相似［1，8-11］。

我国食品卫生法规标准GB2762规定，蔬菜中亚硝酸盐限量指标为≤4 mg/kg［13］。本文研究结果提示，通过控制冷藏温度、食盐浓度及pH值可有效防止栖冷克吕沃尔菌在蔬菜中生长繁殖，避免由该菌大量繁殖引起亚硝酸盐大量积累。

有文献指出，姜中含有线性和环状的二苯基庚烷类化合物，该类化合物具有抗氧化性，能抑制氧分子自由基的生成，从而对亚硝酸盐的产生有一定程度的阻断作用［13-14］。本研究中，污染栖冷克吕沃尔菌的各品种姜蓉所达到的亚硝酸盐峰值，与其初始硝酸盐含量不成正相关，结果提示姜蓉在模拟污染试验中产生的亚硝酸盐主要与栖冷克吕沃尔菌的大量繁殖有关，还可能与姜蓉中二苯基庚烷类化合物等其他因素有关。

表4 不同姜蓉中细菌浓度随时间变化结果(8℃)

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