邱志东 缪辉来 雷长江 刘忠考 黎 然 包仕廷

广东医学院附属医院肝胆外科，广东湛江 524001

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican-3，GPC3）被发现常在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中高表达，在HCC的发生发展中具有重要作用[1-2]。RNA干扰（RNA interference，RNAi）目前是一种成熟的研究基因功能的方法[3]，本研究先设计特异靶向GPC3的siRNAs，然后进行筛选，并进一步验证有效抑制GPC3表达后对肝癌细胞增殖能力的影响，以此探讨GPC3在HCC中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肝癌细胞Huh7（南方医科大学病理研究所），DMEM、lipofectamine 2000和Trizol（Invitrogen），RT-PCR试剂盒（TaKaRa），SYBR Green PCR Master Mix（Toyobo），GPC3一抗和二抗（Novus Biologicals）。

1.2 细胞培养

Huh7细胞培养于含10%胎牛血清和双抗的高糖DMEM中，置于37℃、含5% CO2的细胞培养箱内培养，用0.25%的胰酶进行消化、传代。

1.3 siRNA设计合成

根据GPC3（Genbank号：NM_001164617）的序列，运用在线设计工具siSearch和sFold设计合成靶向GPC3的siRNA，并交由上海吉玛制药技术有限公司合成，序列如下：

表1 siRNA序列

1.4 siRNA转染

转染前1天，细胞接种6孔板，接种浓度为1×105个细胞/mL，每孔1 mL；第2天当细胞汇合度达到70%左右时进行转染，步骤参考说明书进行，siRNA终浓度设3个梯度为25 nmol（/L·孔）、50 nmol（/L·孔）、75 nmol（/L·孔）；4～6 h后，更换完全培养基，72 h后进行后续检测。

1.5 荧光定量PCR检测

收集细胞，加入1 mL Trizol提取总RNA，定量后用1μg RNA进行逆转录，SYBR-Green染料法进行定量PCR，20μL体系含100 ng cDNA。反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40 cycles。每个样做 3个重复，定量分析通过比较 2-ΔΔCt值进行。GPC3 和内参 GAPDH 定量所用引 物 为：GPC3-F：5'-AGAAACCTTATCCAGCCGAAGAA-3’；GPC3-R：5'-TGGGTCCAACTACTAAGCT-3’。GAPDH-F：5'-GGTATCGTGGAAGGACTC-3’；GAPDH-R：5'-GTAGAGGCAGGGATGATG-3’。

1.6 Western Blot

细胞收集后用PBS洗涤2次，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA buffer（1X PBS，1% NP-40，0.1% SDS，5 mmol/L EDTA，0.5%脱氧胆酸钠和1 mmol/L正钒酸钠）裂解细胞。蛋白样品定量后，于8% SDS-PAGE上进行分离，并电转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉溶液进行封闭。加入稀释到合适浓度的GPC3和GAPDH一抗，于4℃孵育过夜进行免疫杂交。然后加入HRP标记的抗兔二抗，最后加入West Femto化学发光检测底物（PIERCE）进行反应，显影检测。

1.7 细胞增殖检测

培养细胞到汇合度达80%左右时，按EdU Apollo DNA in vitro Kit（锐博）说明书每孔加入100 μL含50μmol/L EdU培养基孵育2 h；弃培养液，每孔加入100 μL细胞固定液（含4%多聚甲醛的PBS）室温孵育15～30 min，再加入2 mg/mL甘氨酸孵育10 min；PBS冲洗，每孔加入100 μL渗透剂（含0.5%TritonX-100的PBS）透化细胞；加入100 μL的1X Apollo染色反应液，避光、室温孵育30 min；加入100 μL 1X Hoechst 33342反应液，避光、室温孵育10～30 min；洗脱Hoechst33342反应液，荧光显微镜观察。

1.8 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（± s）表示。荧光定量PCR和免疫蛋白印迹检测实验采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较各组间差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 特异靶向GPC3的siRNA筛选

不同浓度的siRNA转染细胞后，荧光定量PCR检测结果显示，当siRNA GPC3-homo-1633使用量为50 nm时沉默效率最高，为74.87%，而其他浓度和siRNA抑制效果均不超过70%（图1），因此后续实验选择GPC3-homo-1633进行。

图1 Real-time PCR检测靶向GPC3的siRNA的抑制效果

2.2 靶向GPC3的siRNA对GPC3蛋白水平的影响

用Western Blot检测GPC3-siRNA-1633对GPC3表达的影响，结果表明：在Huh7细胞中GPC3的表达能明显被抑制（图2）。因此，在Huh7细胞中，GPC3-homo-1633能特异靶向GPC3，导致GPC3转录翻译下调。

图2 Western Blot检测siRNA GPC3-homo-1633对GPC3表达的抑制效果，内参为GAPDH

2.3 GPC3表达下调会抑制Huh7细胞增殖

利用特异siRNA下调GPC3表达后，发现EdU阳性的Huh7细胞显著减少（图3），这说明GPC3表达沉默能抑制Huh7细胞增殖。

图3 siRNA下调GPC3表达后Huh7细胞增殖检测

3 讨论

全球原发性肝癌的发病率大约占所有肿瘤发病率的6%，其中有一半以上发生在中国[4]，且其死亡率在恶性肿瘤中排第3 位[5]。越来越多的研究表明GPC3对于HCC，特别是对于AFP阴性的HCC，可能是一种新的、高灵敏性和特异性的HCC标志物[6-9]。

本研究成功筛选出能特异靶向GPC3的siRNA，可以显著抑制GPC3的转录翻译。而当GPC3表达下调后，发现Huh7细胞的增殖受到抑制。因此，可认为在HCC中GPC3具有癌基因作用，该基因的表达能够促进HCC的增殖能力。这与Sun等[10]的研究结果一致，他们通过转染GPC3特异的siRNA后，也发现HCC的生长受到抑制，且出现G1期细胞周期滞留。而Ruan等[11]通过转染靶向GPC3的shRNA表达载体下调GPC3表达后，发现MHCC97-H细胞的增殖和侵袭能力均明显被抑制。

本研究结果证明GPC3通过影响细胞的增殖而对HCC的生长起促进作用，但GPC3对HCC的影响作用其具体机制目前还没有研究清楚，有可能通过多种信号通路起作用。因此，还需要进一步研究GPC3在HCC中的具体作用，为HCC的防治提供理论基础。

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