邱志东 缪辉来 雷长江 刘忠考 黎 然 包仕廷

广东医学院附属医院肝胆外科，广东湛江 524001

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican-3，GPC3）被发现常在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中高表达，在HCC的发生发展中具有重要作用[1-2]。RNA干扰（RNA interference，RNAi）目前是一种成熟的研究基因功能的方法[3]，本研究先设计特异靶向GPC3的siRNAs，然后进行筛选，并进一步验证有效抑制GPC3表达后对肝癌细胞增殖能力的影响，以此探讨GPC3在HCC中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肝癌细胞Huh7（南方医科大学病理研究所），DMEM、lipofectamine 2000和Trizol（Invitrogen），RT-PCR试剂盒（TaKaRa），SYBR Green PCR Master Mix（Toyobo），GPC3一抗和二抗（Novus Biologicals）。

1.2 细胞培养

Huh7细胞培养于含10%胎牛血清和双抗的高糖DMEM中，置于37℃、含5% CO2的细胞培养箱内培养，用0.25%的胰酶进行消化、传代。

1.3 siRNA设计合成

根据GPC3（Genbank号：NM_001164617）的序列，运用在线设计工具siSearch和sFold设计合成靶向GPC3的siRNA，并交由上海吉玛制药技术有限公司合成，序列如下：

表1 siRNA序列

1.4 siRNA转染

转染前1天，细胞接种6孔板，接种浓度为1×105个细胞/mL，每孔1 mL；第2天当细胞汇合度达到70%左右时进行转染，步骤参考说明书进行，siRNA终浓度设3个梯度为25 nmol（/L·孔）、50 nmol（/L·孔）、75 nmol（/L·孔）；4～6 h后，更换完全培养基，72 h后进行后续检测。

1.5 荧光定量PCR检测

收集细胞，加入1 mL Trizol提取总RNA，定量后用1μg RNA进行逆转录，SYBR-Green染料法进行定量PCR，20μL体系含100 ng cDNA。反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40 cycles。每个样做 3个重复，定量分析通过比较 2-ΔΔCt值进行。GPC3 和内参 GAPDH 定量所用引 物 为：GPC3-F：5'-AGAAACCTTATCCAGCCGAAGAA-3’；GPC3-R：5'-TGGGTCCAACTACTAAGCT-3’。GAPDH-F：5'-GGTATCGTGGAAGGACTC-3’；GAPDH-R：5'-GTAGAGGCAGGGATGATG-3’。

1.6 Western Blot

细胞收集后用PBS洗涤2次，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA buffer（1X PBS，1% NP-40，0.1% SDS，5 mmol/L EDTA，0.5%脱氧胆酸钠和1 mmol/L正钒酸钠）裂解细胞。蛋白样品定量后，于8% SDS-PAGE上进行分离，并电转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉溶液进行封闭。加入稀释到合适浓度的GPC3和GAPDH一抗，于4℃孵育过夜进行免疫杂交。然后加入HRP标记的抗兔二抗，最后加入West Femto化学发光检测底物（PIERCE）进行反应，显影检测。……