何 斌 孙晓青

1)徐州医学院肿瘤生物治疗实验室 徐州 221002 2)徐州医学院附属医院泌尿外科 徐州 221002

Gli－1基因的RNAi对前列腺癌DU145细胞的影响

何 斌1)孙晓青2)

1)徐州医学院肿瘤生物治疗实验室 徐州 221002 2)徐州医学院附属医院泌尿外科 徐州 221002

目的 研究胶质瘤相关癌基因1(Gli－1)对前列腺癌DU145细胞的生物学影响。方法 通过脂质体介导的方法将Gli－1 SiRNA转染前列腺癌DU145细胞，RT－PCR检测Gli－1 mRNA变化，Western Blot法检测其蛋白的表达，CCK－8法检测转染后细胞增殖，运用Transwell小室法检测细胞侵袭能力的变化。结果 转染Gli－1SiRNA的细胞Gli－1的表达明显低于阴性对照组(NC)与空白组(P﹤0.05)，Gli－1SiRNA抑制细胞增殖并降低细胞的侵袭能力。结论 Gli－1 SiRNA可抑制前列腺癌DU145细胞中Gli－1的表达，降低细胞增殖率和侵袭能力，提示Gli－1可能在前列腺癌的恶性进展中起着重要作用。

前列腺癌;Gli－1;SiRNA;侵袭

前列腺癌是生殖系最常见的恶性肿瘤之一，晚期易进展为非激素依赖性前列腺癌。近年来发现Hh(Hedgehog)－Gli信号通路在前列腺癌发生发展中其关键作用，而Gli－1作为该通路下游转录激活子在肿瘤研究中受到广泛关注［1］，DU145为雄激素非依赖性细胞，侵袭力强且高表达Gli－1［2］，鉴于此本研究构建针对Gli－1基因的小分子干扰RNA(small interfering RNA，SiRNA)序列，转染入DU145细胞，观察SiRNA对DU145细胞增殖和侵袭能力的影响，有望为非雄激素依赖性前列腺癌治疗提供新的思路和方法。

1 材料和方法

1.1 材料根据Genbank报道的homo Gli－1(Gene ID 2735)由上海吉玛制药技术有限公司合成Gli－1SiRNA双链，序列见表1。人前列腺癌 DU145细胞株购自中科院上海细胞研究所，Ham’s F12培养基、胎牛血清(Fatal bovine serum，FBS)为Hyclone公司产品，LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品，RNA提取试剂盒购自北京TIANGEN公司，RT－PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，引物由上海生工合成，RIPA裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)购自碧云天公司，Gli－1多克隆抗体为武汉博士德公司产品，CCK－8购自日本株式会社同仁化学研究所，Matrigel基质胶为BD公司产品，纤维粘连蛋白(fibibronectin，FN)为Sigma公司产品，Transwell小室为Corning公司产品。

表1 Gli－1 SiRNA序列

1.2 DU－145细胞的培养及转染DU－145细胞用含10%FBS的Ham’sF12的培养液置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，取生长良好且处于对数生长期的细胞以2.5×105个/孔的密度接种于6孔板，待细胞融合达50%，参照吉玛公司SiRNA使用指南配制脂质体与SiRNA复合物转染DU145细胞。实验分为3组:(1)未转染SiRNA的空白组。(2)转染NC SiRNA的阴性对照组⑶转染Gli－1 SiRNA的实验组。

1.3 RT－PCR检测RNAi后Gli－1 mRNA变化DU145转染后48 h，加入Trizol 1mL按照其说明书总提RNA，将RNA浓度调至0.5μg/μL。取 RNA 4μL逆转录合成 cDNA，用 dNTP(10 mmol/L)1μL，Mgcl2(25 mmol/L)4μL，10×B μffer 5 μL，上下游引物(10 μM)2 μL，DNA聚合酶0.3μL，cDNA 5μL，无核酶水32.7μL的反应体系进行PCR。Gli－1上游引物:GGACAACCGCCATCCAGACT，下游引物:GCCAGGGACACCTCCATCTC，产物长度363bp;β－actin上游引物GTTGCTATCCAGGCTGTGC，下游引物GCATCCTGTCGGCAATGC，产物长度248 bp。扩展条件如下:95℃预变性5 min，94℃变性45 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35个循环，再72℃延伸5 min。将RT－PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，数字成像系统拍照分析。

1.4 Western Blot法检测RNAi后Gli－1蛋白的表达取转染48 h后各组细胞，收集细胞提取蛋白，取BCA法蛋白定量后每个泳道加50 μL蛋白样品，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将蛋白转移到硝酸纤维素膜(NC)上，5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤，二抗室温孵育2 h，NBT/BCIP显色。蛋白条带以β－actin为参照，测定数据以各组条带的吸光度/对照组条带吸光度表示，筛选最优干扰组。

1.5 CCK－8检测RNAi后DU145细胞增殖情况将DU145以胰酶消化计数后接种于96孔板上，每孔约1000个细胞，进行转染并分为3组:空白组，NC组与Gli－1 SiRNA最优干扰组。置入培养箱中24 h，每隔24 h在各组待测孔中加入10μL CCK－8，置于培养箱中培养2 h，在酶标仪上以波长450 nm检测待测孔光密度值，每组每次6复孔，计算平均值与标准差，连测3 d，绘制细胞生长曲线，重复3次。

1.6 细胞侵袭实验检测RNAi后侵袭能力Transwell小室上室加入50μL稀释的Matrigel基质胶，下室加入的10μg/mL的FN 50μL，超净台风干过夜。用前以无血清培养基水化基底膜置入37℃培养箱孵育1 h。取转染24 h各组细胞，无血清培养基制备成2×105/mL的细胞悬液，取200 μL细胞悬液，接种至Transwell上室铺匀，在下室内加入含10%FBS的培养基600 μL，每组设3个复孔，常规培养36 h。取出Transwell小室，棉签擦去上室细胞，95%甲醇固定30min，结晶紫染色30min，PBS冲洗，镜下随机选取4个视野，计数穿膜细胞数。

1.7 统计学处理计量资料以均数±标准差表示，应用SPSS 13.0统计分析软件对实验数据进行统计学处理，采用单因素方差分析进行数据分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Gli－1 SiRNA下调DU145细胞中Gli－1的Mrna结果显示，实验组Gli－1 mRNA表达均低于阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，mRNA表达量(%)分别为阴性对照组98.2±6.6，SiRNA－1为63.3±3.2，SiRNA－2为53.8±4.6，SiRNA－3为38.4±4.0，以SiRNA－3沉默效果最佳。见图1

2.2 Gli－1 SiRNA抑制DU145细胞中Gli－1的蛋白表达结果显示，实验组Gli－1蛋白表达均低于阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，蛋白表达量(%)分别为阴性对照组94.9±7.9，SiRNA－1组55.7±5.6，SiRNA－2组42.6±3.2，SiRNA－3组31.9±5.1，SiRNA－3确为最佳干扰组。见图2

2.3 Gli－1 SiRNA抑制DU145细胞的增殖结果显示，实验组增殖低于阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，72 h相对增值率(%)分别为阴性对照组(97.1±1.8)%，SiRNA－3组39.6±2.6。见图3

2.4 Gli－1 SiRNA减弱DU145细胞的侵袭力在沉默Gli－1基因表达后，DU145细胞在Transwell小室内的穿膜细胞数(个)分别为空白对照组269±15，阴性对照组263±21，SiRNA－3组165±24，差异有统计学意义(P＜0.05)。表明SiRNA－3可降低细胞侵袭能力。见图4

3 讨论

Hh－Gli信号通路的异常激活在人类恶性肿瘤的发生发展中起着重要作用，其中包括前列腺癌［3］，通路在调控前列腺发育与前列腺癌的发生、发展与激素抵抗等方面发挥的重要作用已被多数研究证实［2，4－5］，2005年美国国家癌症研究所将该通路列为前列腺癌靶向治疗的靶标，雄激素受体排次要地位［6］。该信号通路由Hh基因，跨膜受体smo与ptch，转录因子Gli家族(Gli－1、Gli－2、Gli－3)与下游目的基因构成，Hh基因编码一系列糖蛋白，当没有Hh信号分子时，Smo被Ptch所抑制，阻碍信号转导;当Hh信号分子存在时，Ptch与Hh蛋白结合，解除了对Smo的抑制，Smo活化后向胞内传递信号给Gli，Gli进入细胞核以后激活目的基因转录［7］。Gli家族作为该通路最后一环，各成员的功能并不完全相同，多数情况下Gli－2与Gli－1功能一致，为Hh－Gli通路下游转录激活子，而Gli－3则起抑制作用［1］。

Gli－1作为Hh－Gli通路下游被广泛承认的转录激活因子，并可作为Shh－Gli通路活化的标记，这一点已为大众认知［8］。Gli－1通过以下机制诱导肿瘤产生:上调细胞周期调节分子Cyclin D2表达量促进细胞有丝分裂，不断增殖［9］;激活抗凋亡因子bcl－2转录活性来抑制凋亡;激活VEGF、Cyclin D等提高细胞侵袭转移能力，且参与肿瘤细胞增殖或扩散的效应分子(如BMP、Cyclin D等)已被证实为Hh－Gli通路的下游分子［10］。Sanchez等使用RT－PCR对肿瘤标本进行检测，发现标本中Gli－1高度表达［11］。Karhadkar等发现在前列腺癌细胞系(PC－3、DU－145、LnCAP及CWR22RV1)均有Gli－1高表达，增加Gli的异位表达则可促使低转移前列腺癌细胞向高转移性癌细胞转化［2］。目前针对Hh信号通路的环靶明等药物只能针对Hh通路上游基因突变导致的肿瘤有效，在Smo级联反应以下的一些参与Hh通路调控的分子变化则没有意义且毒性较大限制了在临床上的应用。作为Hh通路的最终效应蛋白，针对Gli直接对Hh通路下游目的基因的激活进行阻断，可以更好的抑制前列腺癌细胞的增殖、分化及侵袭。

在本实验中，通过使用Gli－1 SiRNA阻断Hh－Gli－1通路，发现可以明显减少前列腺癌 DU145细胞中Gli－1基因mRNA及其蛋白的表达，明显抑制该细胞生长、侵袭能力，表明了Gli－1 SiRNA可以特异性抑制内源基因表达，抑制DU145细胞增殖和体外侵袭能力，为前列腺癌的基因治疗提供了新的思路。

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1007－8991(2012)05－0018－04

(收稿 2012－03－27)