龚 鑫 熊克仁＊ 汪仁平

扬子鳄新皮质NOS、ACh E阳性神经元的分布

龚 鑫1熊克仁1＊汪仁平2

（1皖南医学院解剖学教研室，芜湖241002；2安徽省扬子鳄繁殖研究中心，宣城242000）

目的 观察扬子鳄新皮质内一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，ACh E）阳性神经元的形态和分布，为扬子鳄脑的比较解剖学积累资料，为其机能研究提供形态学依据。方法 采用还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶（NADPH-d）法和亚铁氰化酮法观察扬子鳄新皮质内NOS和ACh E阳性神经元的分布和特征。结果 扬子鳄新皮质内有NOS和ACh E阳性神经元分布，为大、中、小型细胞，以中小型细胞为主，胞体呈圆形、椭圆形、三角形和梭形。结论 扬子鳄新皮质内有NOS和ACh E阳性神经元分布。

新皮质；一氧化氮合酶；乙酰胆碱酯酶；扬子鳄

扬子鳄是我国特有的珍稀野生动物，是全球23种鳄鱼中最濒危的鳄类，已被列为国家一级重点保护野生动物。它在进化过程中处于由水生到陆生的关键过渡阶段，对其神经系统的研究具有重要的意义。新皮质作为扬子鳄端脑的重要组成部分之一，其内NOS和ACh E阳性神经元的分布尚未见有报道，本实验采用组织化学的方法对其新皮质内NOS和ACh E阳性神经元的分布进行研究，为进一步了解扬子鳄新皮质的功能提供基础形态学资料。

材料和方法

1.实验动物

7岁龄扬子鳄5条，由安徽省扬子鳄繁殖研究中心提供。

2.方法

扬子鳄处死后立即断头取脑，入含20%蔗糖的固定液（2%多聚甲醛、1.25%戊二醛的0.1 mol／L磷酸缓冲液p H 7.4）内，4℃冰箱过夜，待组织下沉后冰冻切片，片厚40μm，切片分成两套，第一套切片用0.01 mol／L磷酸盐缓冲液（PBS）接片，洗涤3次，每次3 min；切片入孵育液（为含1g／L NADPH-d、1.2 mmol／L NBT 和0.3%Triton X-100的0.1 mol／L磷酸缓冲液）中，37℃温箱孵育1h，反应结束后，将切片移入PBS（p H 7.4）内清洗3次，每次3 min，贴片、干燥、脱水、透明、封片、显微镜下观察。第二套切片用0.01 mol／L PBS接片，经双蒸水清洗2次，每次3 min，然后浸入反应液（含①醋酸盐缓冲液p H5.5，6.5 ml；②0.1 mol／L柠檬酸钠0.5 ml；③30 mmol／L硫酸铜1 ml；④双蒸水1 ml；⑤5 mmol／L铁氰化钾1 ml。依次加入各液体，最后将碘化硫代乙酰胆碱5 mg溶于上述液体中即成为反应液），在37℃温箱内孵育1h，反应结束后将切片移入双蒸水内清洗2次，每次3 min，贴片、干燥、脱水、透明、封片，采用读数显微镜和黑马病理图像分析系统进行细胞大小及形态特征的观察。

3.细胞大小的划分

胞体直径在10μm以下的细胞为小型细胞，直径在10-20μm之间的细胞为中型细胞，直径在20μm以上的细胞为大型细胞［1］。

4.统计处理与分析

用SPSS13.0软件进行统计分析。数值变量资料以均数±标准差（¯x±s）表示，两组之间比较采用t检验或秩和检验。以P＜0.05作为判定有统计学意义的依据。

结 果

1.扬子鳄新皮质内NOS阳性神经元的分布及特征

NOS阳性神经元胞质和突起被染成紫蓝色，胞核不着色或淡染呈空泡状。扬子鳄新皮质内有NOS阳性神经元分布，细胞染色较深，细胞大小以中小型细胞为主，可见少量大型细胞，胞体和突起清晰，突起较长，胞体以椭圆形最为多见，圆形、三角形和梭形三种细胞数大致相当（图1、2）。随机选取20张新皮质切片，进行统计计数（表1、2）。

2.扬子鳄新皮质内ACh E阳性神经元的分布及特征

ACh E阳性反应物为棕色沉淀，因此ACh E阳性神经元的胞质和突起呈棕红色，胞核染色较淡或不着色。扬子鳄新皮质内可见到较为密集的ACh E阳性神经元，以中小型细胞为主，胞体和突起清晰，突起较长，胞体以三角形、椭圆形多见，另可见少量圆形和梭形细胞（图3、4）。随机选取20张新皮质切片，进行统计计数（表1、2）。

图1 新皮质 NOS阳性神经元 ×40 Fig.1 NOS positive neurons in the neocortex×40图2 新皮质 NOS阳性神经元 ×100 Fig.2 NOS positive neurons in t he neocortex×100图3 新皮质 ACh E阳性神经元 ×40 Fig.3 ACh E positive neurons in the neocortex×40图4 新皮质 ACh E阳性神经元 ×100 Fig.4 ACh E positive neurons in the neocortex×100

表1 扬子鳄新皮质NOS、ACh E阳性神经元大小分布（¯x±s）Table 1 The size of NOS and ACh E positive neurons in the neocortex of Alligator sinensis（¯x±s）

表2 扬子鳄新皮质NOS、ACh E阳性神经元形态分布（¯x±s）Table 2 Table 2 The shape of NOS and ACh E positive neur ons in the neocortex of Alligator sinensis（¯x±s）

讨 论

从低等脊椎动物开始，端脑的内侧壁上份是海马，前下方是隔，外侧壁称梨状皮质，下壁是纹状体，爬行类动物由于纹状体增厚，向侧脑室内隆突，侧脑室顶部的细胞向脑表迁移形成新皮质。同其它爬行动物相似，扬子鳄大脑半球被侧脑室分为背侧较薄的皮质部和腹侧较厚的基底部，其皮质部可分为三部分，即内侧的海马皮质，背侧的新皮质，外侧的梨状皮质［2］。在种系发生上，大脑皮质一般分为新皮质和异生皮质，后者由古皮质（海马结构）和旧皮质（梨形叶）组成。随着进化的发展，到高等哺乳动物，新皮质高度增大，特别是人类的新皮质高度发达，约占据全部皮质的96%，分为额、顶、枕、颞、岛叶。新皮质与感觉和运动系统的发展相伴随，并与视觉、听觉以及学习记忆等诸多功能有关［3］。

一氧化氮（NO）作为一种重要的神经递质，与学习记忆有密切关系，它已被证实是LTP（长时程增强效应）突触机制中的一种必需的气体信使分子，其主要作用是进一步促进神经递质的释放，对LTP的维持和长期记忆的形成至关重要［4］；NO还广泛参与了视觉、听觉等躯体感觉信息的形成、整合和传递［5，6］；NO可引起内源性多巴胺释放且呈正比关系，从而参与皮质-纹状体-丘脑-皮质反馈抑制环路的调节及躯体运动的调节［7］。乙酰胆碱（ACh）是胆碱能神经的化学递质，中枢胆碱能系统通过大脑皮质和边缘系统调节学习和记忆过程［8］。中枢神经系统内胆碱能系统与运动调节密切相关，长期适量运动能提高皮质与海马内胆碱能纤维密度［9］。本实验观察到在扬子鳄新皮质内均有NOS、ACh E阳性神经元分布，提示其内的NO和ACh两种神经递质可能在扬子鳄的学习记忆、躯体感觉信息的形成、整合和传递以及运动的调节活动中发挥着作用。另外本实验观察到，在扬子鳄新皮质内这两种神经元中ACh E阳性神经元数量明显多于NOS阳性神经元，我室曾观察扬子鳄大脑皮质的其它两个区域梨状皮质和海马皮质这两种神经元的分布，其中梨状皮质内NOS阳性神经元数量较少、排列疏松，而ACh E阳性神经元数量丰富，排列相对密集［10］；海马皮质内ACh E阳性神经元数量较多，NOS阳性神经元数量相对较少，ACh E阳性神经元数量约为NOS的3.5倍，且排列密集［11］，与新皮质内这两种神经元分布情况相类似，ACh E阳性神经元数量均明显多于NOS阳性神经元。提示在扬子鳄大脑皮质的功能调控中胆碱能神经元可能发挥着主要的作用。

有研究报道，低等脊椎动物鱼类大脑皮质的NOS阳性神经元数量较少，胞体主要呈圆形和三角形［12］，爬行动物蛇类端脑背内侧部有少量的NOS阳性神经元，胞体形态主要呈多角形和梭形［13］。在高等哺乳动物中兔的大脑皮质各个区域均可见到散在NOS阳性神经元，NOS阳性神经元胞体大小不一，可分为大、中、小3类，呈卵圆形、梭形、多角形［14］；小鼠大脑皮质内可见到密集的、体积较小的NOS阳性细胞，胞体形态多数为锥形、星状细胞，少数为椭圆形和梭形细胞［15］；另外在大鼠额叶皮质中有ACh E阳性神经元，细胞形态呈多角形、圆形、长椭圆形［16］。本研究中观察到两栖爬行动物扬子鳄新皮质内有NOS和ACh E阳性神经元分布，其中NOS阳性神经元数量较少，胞体形态有椭圆形、圆形、三角形和梭形，以椭圆形最为多见；ACh E阳性神经元数量较多，排列较为密集，胞体以三角形、椭圆形多见，另可见少量圆形和梭形细胞。扬子鳄新皮质与以上动物大脑皮质内这两种神经元在数量和形态上的差异可能与物种及进化程度的不同有关。本实验采取的是扬子鳄大脑水平连续冰冻切片，是从新皮质水平切面上观察其内NOS和ACh E阳性神经元的大小和形态，能基本反映扬子鳄新皮质内这两种神经元的形态特征，如要更精确的测量和观察扬子鳄新皮质内这两种神经元的大小和形态，还有待进一步运用三维重建图像技术来进行观察。

有研究观察到，在哺乳动物兔脑内NOS阳性神经元的密度、第一级突起数和最长突起长度随着年龄增长而逐渐减少，而胞体直径却随年龄增长而逐渐增大［14］；在大鼠胚胎的第17天和20天及生后14天NOS阳性神经元数量逐渐增多，胞体增大，突起逐渐清晰，并相互交织成网［17］。在青年组（3-5月龄）和老年组（24-27月龄）大脑皮质内均可见到ACh E阳性神经元和阳性纤维，青年组大鼠大脑皮质ACh E阳性纤维粗长，且分布密集，交织成密网，纤维间联系十分丰富，老龄组大鼠皮质ACh E阳性纤维细短，纤维间联系松散［18］。提示NO和ACh两种重要的神经递质，在中枢神经系统的发育、成熟和衰老过程中具有重要作用，NOS和ACh E阳性神经元在不同的年龄扬子鳄新皮质内数量、形态是否有变化，NO和ACh两种神经递质在扬子鳄脑内的发育、成熟和衰老过程中是否发挥着重要作用，还有待进一步研究。

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Distribution of NOS and ACh E positive neurons in the neocortex of alligator sinensis

Gong Xin1， Xiong Keren1＊， Wang Renping2
（1Depart ment of Anatomy，Wannan Medical College，Wuhu 241002，2Anhui Research Centre of Alligator Sinensis Repr oduction，Xuancheng 242000，China）

Objective To observe the distribution of nitric oxide synthase（NOS）and acetylcholinesterase（ACh E）positive neur ons in t he neocortex of Alligator sinensis.Theref ore，to accu mulate data f or comparative anato my of Alligator sinensis＇brain，and to provide morphological foundation f or its f unctional research.Methods The nicotina mide adenosine dinucleotide phosphate diaphorase（NADPH-d）and acetylcholinesterase histochemical technique were used to obser ve t he distribution and mor phol ogy of NOS and ACh E positive neurons in the neocortex of Alligator sinensis.Results The NOS and ACh E positive neurons were obser ved in t he neocortex of Alligator sinensis.They were lar ge，middle or s mall sized cells，but most of them were middle and small.The cell bodies were round，oval，triangular or f usifor m in shape.Concl usion The neocortex of Alligator sinensis contains NOS and ACh E positive neur ons.

Neocortex；Nitric oxide synt hase；Acetylcholinesterase；Alligator sinensis

R

A

10.3870／zgzzhx.2012.02.016

2011-11-14

2012-02-20

皖南医学院中青年科研基金项目资助（WK2006-09 A）

龚鑫，男（1979年），汉族，讲师。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）