周华妙 郭 勇 浙江省中医院 杭州 310006

结直肠癌的发病涉及多种因素及步骤，而肿瘤的浸润和转移更是提高结直肠癌临床疗效和生存期的主要障碍，很多结直肠癌患者在发现时已是晚期，有远处转移，所以控制转移成为决定癌症患者预后的关键因素。中医认为，“毒、虚、瘀”是肿瘤及肿瘤转移的主要病因，而血瘀证是恶性肿瘤患者的主要证候之一，临床肿瘤转移患者多见不同程度的血瘀症状。孙秉严将临床各种肿瘤分为八证，其中寒瘀毒结最为多见，占肿瘤患者80%以上［1］。由此认为，除毒、虚、瘀外，“寒”是肿瘤晚期患者的又一病理特点，“血瘀”、“寒凝”与毒邪胶结不解，既加重病情，又促使转移。然而一直以来，对肿瘤晚期患者出现的血瘀证是否应用活血化瘀疗法存在争议。有人认为，血瘀证是肿瘤晚期患者为了抑制肿瘤增殖、转移的一种保护机制，活血化瘀能促进肿瘤的转移，加速疾病进展。基于上述背景，我们根据中医实验动物模型方法学，建立寒凝血瘀证C26结肠癌小鼠人工血行肺转移模型，观察其肺组织VEGF、MMP-2表达，探讨寒凝血瘀对结直肠癌及其转移的影响，报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康雌性8周龄Balb/c小鼠24只（中国医学科学院上海实验动物中心提供），SPF条件下饲养：温度24±2℃，湿度55±5%，噪音＜50db，每12h 1次亮暗循环，2周更换1次敷料，用无菌营养颗粒饲料饲养。

1.2 实验瘤株 小鼠结肠腺癌细胞colon-26（C26），购自上海细胞库。

1.3 药物及试剂 生理盐水（常州康普药业有限公司，批号0905025）；0.1%盐酸肾上腺素（天津金耀氨基酸有限公司，批号H12020526）。Marker（Ferment公司），脱脂奶粉（光明乳液股份有限公司），化学发光试剂A、B（Millipore Corparation公司），羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（Santa Cruz公司），MMP-2一抗、VEGF一抗（Abcom 公司），胎牛血清（Hyclone公司），显影液、定影液及胶片（Kodak公司），蛋白定量试剂盒A、B（Bio-rad公司）。

2 实验方法

2.1 分 组 应用计算机生成的随机数字表将24只小鼠随机分为空白对照组、寒凝血瘀组、单纯荷瘤组和复合造模组，每组6只。

2.2 造 模 参照文献［2］方法，空白对照组小鼠每天定点皮下注射生理盐水0.1mL，1h后进行1次常温水浴4min，水浴后1h再次皮下注射生理盐水0.1mL，连续4周，后2周隔天进行，第15天经尾静脉注射生理盐水0.1mL。寒凝血瘀组小鼠每天定点皮下注射0.1%肾上腺素0.08mL/kg（用生理盐水稀释至0.2mL），分2次注射，第一次注射后1h，进行冰浴（4℃～6℃）4min，1h后再行第二次注射，连续4周，后2周隔天进行，第15天经尾静脉注射生理盐水0.1mL。单纯荷瘤组小鼠每天定点皮下注射生理盐水0.1mL，1h后进行1次常温水浴4min，水浴后1h再次皮下注射生理盐水0.1mL，连续4周，后2周隔天进行，第15天经尾静脉注射C26单细胞悬液（密度=4×106）0.1mL。复合造模组小鼠每天定点皮下注射0.1%肾上腺素0.08mL/kg（用生理盐水稀释至0.2mL），分2次注射，第一次注射后1h，进行冰浴（4℃～6℃）4min，1h后再行第二次注射，连续4周，后2周隔天进行，第15天经尾静脉注射C26单细胞悬液（密度=4×106）0.1mL。

2.3 标本采集及检测 于造模第28天采用颈椎脱臼法处死各组小鼠，超净台上解剖小鼠，取出全部肺组织，固定于10%福尔马林，常规包埋、石蜡切片，留取部分左肺组织采用免疫组化SP法检测VEGF；将另一部分左肺组织剪碎、碾磨、裂解、离心，取上清液，采用Western Blot检测MMP-2蛋白浓度。多余标本分装标记后冻存于-80℃冰箱中备用。

2.4 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件包，采用秩和检验、方差分析、χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组小鼠肺组织VEGF表达 单纯荷瘤组、复合造模组小鼠结肠癌肺转移灶VEGF表达上调，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；复合造模组VEGF表达率高于寒凝血瘀组和单纯荷瘤组，但组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组VEGF表达率比较

3.2 各组小鼠肺组织MMP-2蛋白含量 单纯荷瘤组、复合造模组MMP-2表达均明显升高，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；寒凝血瘀组MMP-2表达低于复合造模组和单纯荷瘤组（P＜0.01）；复合造模组MMP-2表达高于单纯荷瘤组（P＜0.05）；寒凝血瘀组MMP-2表达虽低于空白对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 各组MMP-2蛋白含量比较（±s） ng/mL

表2 各组MMP-2蛋白含量比较（±s） ng/mL

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与单纯荷瘤组、复合造模组比较，△P＜0.01；与复合造模组比较，▲P＜0.05

6 6 6 6 0.76±0.11 0.69±0.10△1.46±0.14**▲1.65±0.15**空白对照组寒凝血瘀组单纯荷瘤组复合造模组

4 讨 论

新生血管在肿瘤的生长和转移中扮演着重要角色，而血管内皮细胞生长因子（VEGF）直接促进血管内皮细胞增殖，是肿瘤血管新生的主要促生长因子。VEGF与其特异性受体结合后，引起受体二聚化，胞内激酶区构象改变，产生激酶活性催化底物蛋白磷酸化，最终通过信号传导分子的级联反应产生一系列生物效应。在肿瘤组织中，肿瘤细胞、侵入肿瘤的巨噬细胞和肥大细胞能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的形式刺激肿瘤血管内皮细胞，促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞浸润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移。VEGF已成为监测多种肿瘤复发或患者生存率的重要指标，是一个很有价值的肿瘤标志物［3-4］。Zucker等［5］发现肿瘤血管形成早期VEGF可诱导内皮细胞产生组织因子和基质金属蛋白酶，使凝血酶原转化成凝血酶，从而激活明胶酶原A降解原来的基膜，使细胞增殖。孙志勇等［6］研究发现肠癌患者手术治疗前血清VEGF显著高于手术后，且术后复发患者血清VEGF明显高于未复发者，表明血清VEGF参与了肿瘤的浸润、转移与复发。目前认为［7-8］，缺氧是调节VEGF的主要因素之一。研究［9］认为，缺氧可在转录和转录后两个水平上调节VEGF的表达，促进新生血管的生成，加速肿瘤转移。

本实验结果表明，复合造模组和单纯肿瘤组小鼠结肠癌肺转移灶的VEGF表达明显上调（P＜0.05）；复合造模组VEGF阳性表达率与单纯肿瘤组比较虽有上调趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。提示在寒凝血瘀状态下，血液在血管内失去了“如水之流”的状态，黏滞度增高，微循环障碍，血流变慢，加重了肿瘤组织的缺血缺氧，进一步促使肿瘤细胞VEGF表达上调，促进肿瘤组织中新生血管形成，加快了结肠癌的转移。表明VEGF可能是促进结肠癌人工肺转移中微血管生成的主要因子之一。

基质金属蛋白酶是一类具有降解细胞外基质和基底膜能力的蛋白水解酶，是人体内降解细胞外基质的主要酶类，在肿瘤细胞突破基底膜屏障而浸润转移中起重要作用。当细胞恶变时常有MMPs的升高，它们能降解基底膜的骨架成分即各类胶原及蛋白。MMP-2是该蛋白酶家族中主要成员之一，能降解明胶酶和Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅹ型胶原蛋白，所以又称明胶酶或Ⅳ型胶原酶。研究表明［10-13］，在许多肿瘤组织中，都发现有较高MMP-2表达，并且其表达程度与肿瘤的侵袭和转移有关。王康等［14］研究发现，MMP2阳性表达强度及表达阳性率按正常大肠黏膜组织、远癌旁黏膜组织、近癌旁黏膜组织及大肠癌组织的顺序依次增高，认为其过度表达可促进大肠癌的恶性发展，且其程度与表达强度相关。

本实验发现，单纯肿瘤组和复合造模组小鼠肺转移灶MMP-2表达明显增强（P＜0.01）；复合造模组小鼠肺转移灶MMP-2表达较单纯肿瘤组小鼠为高（P＜0.05），说明结肠腺癌小鼠肺转移时MMP-2表达明显增强，而在寒凝血瘀状态下其表达更高，这可能与寒凝血瘀状态下肿瘤组织缺血缺氧更严重，刺激VEGF和MMP-2表达上调有关。说明在寒凝血瘀状态下，MMP-2蛋白高表达，可能促进结肠癌的浸润和转移。

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